Tüm Dağı Diseksiyon ve Yetişkin Fare Kohlea immünofloresan
Summary
Biz üç bozulmamış koklear döner (apeks, orta ve üs) olarak Corti yetişkin organı izole etmek için bir yöntem mevcut. Biz de floresan levhası 'antikorlar ile immün için bir prosedür ortaya koymaktadır. Birlikte bu teknikler kokleadaki bulunan saç hücreleri, destek hücreler ve diğer hücre türleri çalışma sağlar.
Abstract
The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.
Introduction
Temporal kemik içinde yer alan iç kulağın spiral şekilli koklea, Corti, memelilerde işitsel duyu uç organ organı ev sahipliği yapmaktadır. Koklea tonotopically düzenlenen ve yaygın olarak apikal ortadan ayrılır ve bazal tepesi 1 taban ve düşük frekans tespiti yüksek frekanslı ses algılama ile farklı frekans bölgelerine tekabül eden döner bir. Saç hücreleri, Corti organı mechanosensory hücreleri, farelerin 2,3 yaklaşık 6 mm uzunluğunda koklea, uzunluğu çalıştırın. Bu hücreler, merkezi işitsel yapıları tarafından işlenen sinirsel sinyalleri içine, sıvı dolu Membranöz labirent aracılığıyla iletilen ses dalgalarının, mekanik enerjiyi dönüştürmek. Burada anlatılan teknik, (yaş bir hafta yetişkinliğe kadar numuneler için) koklea kalsifikasyonu sonra Corti organı tüm bağlar hazırlanması için bir yöntem, tamamlandığında içerir. Ayrıca immunosta için bir yöntem mevcutbütün ining koklear doku monte edilebilir. Koklear bütün bağlar tüm saç hücrelerinin görselleştirme ve doğal uzamsal düzenlemeler destekleyici hücrelerin çevredeki için çok önemlidir ve konfokal mikroskopi kullanılarak üç boyutlu olarak analiz için izin.
Dr. Hans Engstrom ve Harlow Ades aslında onlar hızla mikroskopik analiz 4 Corti organı kısa bozulmamış kesimleri koruyarak, düzeltmek ve memelilerin çeşitli sıvı batık kalsifiye cochleae incelemek için bir teknik detaylı 1966 yılında bir bütün montaj koklear diseksiyon yöntemi tarif. Bir sabitlenmemiş, kalsifiye sıçan Kokleanın diseksiyonu da bir öğretim video 5'te gösterilen edilmiştir. Dr. Barbara Bohne ve Washington Üniversitesinde Gary Harding bu yönteme pek çok önemli değişiklikler yaptı. Koklear tüm montaj yönteminin kendi versiyonunda, temporal kemik, dekalsifiye oldu plastik gömülü ve beş yarım dönüşler veya on çeyrek dönüşler dissec edildited 6,7. O plastik gömme 8 gerekli değildi bu yüzden Dr. Charles Liberman ve Eaton Peabody Laboratories, Massachusetts Göz ve Kulak Infirmary'de meslektaşları, bu tekniği modifiye. Tekniğin daha da modifikasyon Burada sunulan diseksiyon yöntemi haberdar St. Jude Çocuk Araştırma Hastanesi 9-12 Dr. Jian Zuo'nun laboratuarında meydana geldi. Biz tam apikal, orta ve bazal dönüşler izolasyonuna izin veren Bohne ve Liberman daha Corti, organı erişmek için farklı bir strateji kullanın. Böylece disseke doku büyük ve diseksiyon veya immün işlemleri sırasında kayıp ya da hasar olasılığı daha azdır. Buna ek olarak, güncel yöntem apikal uç veya frekans bölgesini tanımlamak için bazal kanca mesafenin ölçülmesini kolaylaştırır.
Birçok laboratuarları koklear dokusunun immün gerçekleştirin rağmen bu yöntem nereden geldiğini, bu belli değildir. Bunun sonucunda Buffe engellemek için çeşitli tarifler vardırrs ve bireysel birincil antikor performansını etkileyebilir antikor inkübasyon tamponları. Burada, işitsel alanda en yaygın olarak kullanılan antikorlar için de geçerlidir floresan isim levhası antikor ile immünboyama için bir yöntem sunulmaktadır.
Koklea karmaşık şekli, Corti organı hassas yapısı ve kemik kapatma histolojik ve biyokimyasal analiz için bir meydan okuma sağlamak. Çeşitli teknikler şu anda bu zor özellikleri aşmak ve Corti, kendi avantajları ve dezavantajları ile her tekniğin organı içindeki hücreleri görselleştirmek için işitme alanında kullanılmaktadır. Burada sunulan protokol küçük bir değişiklikle, potansiyel olarak bu alanda kullanılan diğer model organizmaların çeşitli cochleae içindeki kritik yapılara incelemek için kullanılabilir, yetişkin fare koklea bütün montaj diseksiyon sağlar ve.
Protocol
Representative Results
Discussion
Başarılı tüm montaj diseksiyonu ve immün için birkaç kritik adımlar vardır. Bu yöntemlerden birini gerçekleştirilir Ancak önce, koklear dokusunun uygun sabitleme gereklidir. Biz metanol, ücretsiz, ultra saf, EM dereceli PFA kullanmanızı öneririz. PFA metanol ve immünofloresan kalitesini düşüren dengesiz bir pH izlerini olabilir toz yaptı. Diğer gruplar, benzer diseksiyon formaldehit 14-16 içermeyen kullanılarak mümkün olan sabitleyiciler olduğunu göstermiştir. Sabitleme uzu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by a grant from the Office of Naval Research (N000141310569). The Southern Illinois University School of Medicine Research Imaging Facility equipment was supported by the National Center for Research Resources-Health (S10RR027716).
Materials
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | can be purchased from other vendors |
| 10.5 cm fine scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | can be purchased from other vendors |
| 2 ml microcentrifuge tubes | MidSci | AVSS2000 | can be purchased from other vendors |
| 16% formaldehyde, methanol free, ultra pure, EM grade | Polysciences | 18814 | TOXIC –wear gloves and cannot be disposed of in the sink. Can be purchased from other vendors. |
| PBS pH 7.4 | Sigma | P3813-10PAK | can be purchased from other vendors |
| EDTA | Fisher | BP118-500 | can be purchased from other vendors |
| end-over-end tube rotator | Fisher | 05-450-127 | can be purchased from other vendors |
| 60 mm petri dish | Fisher | 50-202-037 | can be purchased from other vendors |
| Dow Corning Sylgard 184 silicone encapsulant kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| activated charcoal | Fisher | AC134372500 | can be purchased from other vendors |
| stereo dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000 | can be purchased from other vendors |
| Dumont #4 jeweler's forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #5 jeweler's forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 2.5 mm Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | curved |
| 5 mm Vannas-Tubingen spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | straight |
| 48 well plates | Fisher | 08-772-52 | can be purchased from other vendors |
| 8 well chamber slides | Fisher | 1256518 | can be purchased from other vendors |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500 | can be purchased from other vendors |
| BSA, fraction V | Fisher | BP1605 | can be purchased from other vendors |
| NGS | Vector labs | S-1000 | can be purchased from other vendors |
| NHS | Vector labs | S-2000 | can be purchased from other vendors |
| 3D rotator | Midsci | R3D-710 | can be purchased from other vendors |
| Western blot incubation box XL | Licor | 929-97401 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | can be purchased from other vendors |
| Prolong gold antifade mounting media | Life Technologies | P36930 | can be purchased from other vendors,but mounting medias vary in their ability to protect against photobleaching |
| Superfrost Plus Slides | Fisher | 12-550-15 | can be purchased from other vendors |
| coverslips 22 x 22 x 1 | Fisher | 12-548-B | can be purchased from other vendors |
| clear nail polish | Local drug store | can be purchased from other vendors | |
| cardboard slide folder | Fisher | 12-587-10 | can be purchased from other vendors |
| plastic slide box | Fisher | 03-448-10 | can be purchased from other vendors |
Referências
- Robles, L., Ruggero, M. A. Mechanics of the mammalian cochlea. Physiol Rev. 81 (3), 1305-1352 (2001).
- Ehret, G., Frankenreiter, M. Quantitattive analysis of cochlear structures in the house mouse in relation to mechanisms of acoustical information processing. J Comp Physiol. 122, 65-85 (1977).
- Ou, H. C., Bohne, B. A., Harding, G. W. Noise damage in the C57BL/CBA mouse cochlea. Hear Res. 145 (1-2), 111-122 (2000).
- Engstrom, H., Ades, H. W., Andersson, A. . Structural pattern of the organ of Corti. A systematic mapping of sensory cells and neural elements. , (1966).
- Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse. J Vis Exp. (48), e2442 (2011).
- Bohne, B. A., Harding, G. W. Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology. Hear Res. 109 (1-2), 34-45 (1997).
- Bohne, B. A., Harding, G. W., Ou, H. C., Willott, J. . Handbook of Mouse Auditory Research. , 171-187 (2001).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (2), 781-785 (2008).
- Yu, Y., et al. In vivo proliferation of postmitotic cochlear supporting cells by acute ablation of the retinoblastoma protein in neonatal mice. J Neurosci. 30 (17), 5927-5936 (2010).
- Steigelman, K. A., et al. Polycystin-1 Is Required for Stereocilia Structure But Not for Mechanotransduction in Inner Ear Hair Cells. J Neurosci. 31 (34), 12241-12250 (2011).
- Liu, Z., et al. Age-dependent in vivo conversion of mouse cochlear pillar and Deiters’ cells to immature hair cells by Atoh1 ectopic expression. J Neurosci. 32 (19), 6600-6610 (2012).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. J Vis Exp. (36), e1685 (2010).
- Burns, J. C., On, D., Baker, W., Collado, M. S., Corwin, J. T. Over half the hair cells in the mouse utricle first appear after birth, with significant numbers originating from early postnatal mitotic production in peripheral and striolar growth zones. J Assoc Res Otolaryngol. 13 (5), 609-627 (2012).
- Collado, M. S., et al. The postnatal accumulation of junctional E-cadherin is inversely correlated with the capacity for supporting cells to convert directly into sensory hair cells in mammalian balance organs. J Neurosci. 31 (33), 11855-11866 (2011).
- Meyers, J. R., Corwin, J. T. Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium. J Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).
- Gratton, M. A., Rao, V. H., Meehan, D. T., Askew, C., Cosgrove, D. Matrix metalloproteinase dysregulation in the stria vascularis of mice with Alport syndrome: implications for capillary basement membrane pathology. Am J Pathol. 166 (5), 1465-1474 (2005).
