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Medicina

Un ratón neonatal lesión de médula espinal de compresión Modelo

Published: March 27, 2016
doi:
10.3791/53498
, ,
1Department of Neurosurgery,Oslo University Hospital, 2Norwegian Center for Stem Cell Research,Oslo University Hospital, 3Laboratory of Neural Development and Optical Recording (NDEVOR), Department of Physiology, Institute of Basic Medical Sciences,University of Oslo

Summary

This article describes a method for generating a reproducible spinal cord compression injury (SCI) in the neonatal mouse. The model provides an advantageous platform for studying mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous functional recovery.

Abstract

lesión de la médula espinal (SCI) suele causar déficits neurológicos devastadores, sobre todo a través del daño a las fibras descendentes desde el cerebro a la médula espinal. Un área importante de la actual investigación se centra en los mecanismos de plasticidad adaptativa que subyacen a la recuperación funcional espontánea o inducida después de SCI. recuperación funcional espontánea se informa, es mayor temprano en la vida, que plantea interrogantes interesantes sobre cómo los cambios de plasticidad adaptativa medida que se desarrolla la médula espinal. Para facilitar la investigación de esta dinámica, hemos desarrollado un modelo de SCI en el ratón neonatal. El modelo tiene relevancia para el SCI pediátrica, que está muy poco estudiada. Debido a la plasticidad neuronal en el adulto implica algunos de los mismos mecanismos que la plasticidad neuronal en la vida temprana 1, este modelo puede potencialmente tener alguna relevancia también para los adultos SCI. Aquí se describe el procedimiento completo para la generación de una lesión reproducible de compresión de la médula espinal (SCC) en el ratón neonataltan pronto como postnatal días (P) 1. SCC se consigue mediante la realización de una laminectomía a nivel espinal determinado (aquí se describe en los niveles torácicos 9-11) y luego usando un aneurisma Yasargil mini-clip modificado para comprimir y descomprimir la médula espinal rápidamente . Como se describió anteriormente, los ratones neonatal lesionado puede ser probado por déficit de comportamiento o sacrificada por análisis fisiológico ex vivo de la conectividad sináptica utilizando técnicas de grabación óptica electrofisiológicas y de alto rendimiento 1. Anteriores y en curso los estudios que utilizan la evaluación conductual y fisiológica han demostrado un deterioro dramático de la motilidad aguda de las extremidades posteriores seguida de una recuperación funcional completa dentro de 2 semanas, y la primera evidencia de cambios en los circuitos funcionales a nivel de las conexiones sinápticas identificadas descendente 1.

Introduction

During the last decade, increasing evidence obtained from different spinal cord injury (SCI) models has shown that spinal networks can reorganize spontaneously to contribute to functional recovery1-9. Adaptive plasticity has as a consequence become an important topic in SCI research. It has been shown that plasticity encompasses regrowth of spared axons, sprouting of new axon collaterals and the formation of novel synaptic connections. Much of this knowledge has been obtained from behavioral or anatomical studies in adult animals. An important limitation of adult spinal cord studies is the difficulty of performing high-throughput physiological assessment, which is easier in neonatal preparations1. One major difference is that wholemount ex vivo preparations of the adult brainstem and spinal cord have low viability. Another is that adult spinal tissue is more opaque to light because it is thicker and myelinated. Although recent advances in in vivo imaging (see for example, 10-12) may partially overcome these problems, the possibility of performing high throughput imaging at any desired dorsoventral depth at multiple sites along a given brainstem-spinal cord preparation is currently only feasible in neonates. The immature state of axon myelination in the neonatal spinal cord facilitates high-throughput ex vivo optical recording, thus permitting a dynamic assessment of functional synaptic connections13-17. Combined with genetically encoded calcium reporters and optogenetic stimulation and pharmacology tools, optical approaches can contribute to a deeper understanding of the mechanisms underlying adaptive plasticity.

It is estimated that between 1-10% of all spinal cord injuries affect infants and children18-22. In contrast to adult SCI the pathogenesis and potential for spontaneous recovery in pediatric SCI is less studied. Using a neonatal SCI model can therefore provide more insight into pediatric SCI and contribute to a better understanding of the pathogenetic and recovery mechanisms involved. Moreover, post-SCI plasticity supporting functional recovery in the adult spinal cord is believed to involve at least in part the same mechanisms that govern the development of the central nervous system such as axon growth, branching and formation of new synapses23-26. Thus, using a neonatal SCI model could provide important insights into mechanisms that are also operative in the adult spinal cord, or that could potentially be reinstated in the adult spinal cord (for example by implantation of fetal cells or tissue or of tissue constructed de novo from pluripotent stem cells) to facilitate recovery.

The neonatal mouse thus provides a platform for an integrative, multi-methodological approach to investigating adaptive plasticity following spinal cord injury, in which a combination of behavioral, physiological, anatomical, molecular and genetic methods can be readily employed. Establishing standardized neonatal injury models is an important step in implementing such studies.

Protocol

Este protocolo experimental ha sido aprobado por la Autoridad Nacional de Investigación de Animales en Noruega (Forsøksdyrutvalget, número local experimental aprobación 12.4591), en cumplimiento de la normativa de la Unión Europea mantenimiento de animales (Asociación Europea de Ciencia Animal de Laboratorio Federación). Se hicieron esfuerzos para reducir al mínimo el número de animales utilizados y su sufrimiento. En este artículo se describe el procedimiento utilizado el 1 de tipo salvaje ICR (Región de impresión de datos de control) ratones postnatal (P) día (Jackson, EE.UU.), pero el mismo método también se puede utilizar en las etapas posteriores. 1. La construcción de un sistema de anestesia de gas para ratones recién nacidos (Figura 1) Construir una nariz-máscara de la punta de una jeringa. Conectar este a la llave de paso de 3 vías con un tubo de plástico (Figura 1 – tubo de color rojo y la Figura 2A1). Perforar un pequeño agujero en el lado de la máscara de la nariz y conectarlo a un tubo de plástico para eliminar el desbordamiento de gas de lamáscara. Poner fin a la tubería, ya sea en una bomba de vacío para fijar una ligera presión negativa, o en una campana de humos (Figura 1 – tubos de color verde brillante). Hacer una cámara de anestesia de un plástico x 25 mm placa de Petri de 150 mm (Figura 2A2). Por un lado, hacer un agujero lo suficientemente grande como para acomodar la cabeza del ratón y la máscara de la nariz. En el lado opuesto, hacer dos agujeros más pequeños a través del cual se pueden insertar los tubos de plástico hacia y desde la máscara de la nariz (Figura 1 – tubing verde rojo y brillante, respectivamente). Hacer un tercer agujero en la parte superior de la tapa y se unen a esta tercera tubo de plástico que termina en la bomba de vacío (Figura 1 – tubo verde oscuro). El propósito de esta tercera tubo es asegurar que cualquier exceso de gas que no ha sido capturado por la salida de la máscara de la nariz se retira. Construir una cámara de sueño al hacer un agujero en la parte inferior de cualquier tipo de plato de laboratorio que es lo suficientemente grande como para contain el ratón y tiene un borde suave y uniforme (la abertura del plato debe estar a nivel con la mesa para evitar fugas de gas). Conectar el agujero de la cámara a la de 3 vías llave de paso con un tubo de plástico (Figura 1 – tubo marrón). Coloque la cámara de dormir bajo una campana de humos. Conectar una llave de paso de 3 vías al tubo de salida del vaporizador (Figura 1 – tubo de color amarillo y la Figura 2A3). Conectar la entrada del vaporizador para el suministro de oxígeno (Figura 1 – tubo azul). 2. La modificación de un Aneurisma Yasargil Temporal Mini-clip para crear la herramienta de compresión (Figura 2 y Tabla 1) Colocar el clip firmemente a un soporte con una abrazadera. El uso de una lupa binocular para el control visual, presente por la superficie exterior de la punta de cada cuchilla clip para un espesor final de aproximadamente 150 micras utilizando una piedra de afilar montado en un taladro (Figura 2B y C). </li> Hacer un tapón para el clip mediante la reducción de un corto tramo de tubo capilar de polietileno (Tabla 1) bajo un estereomicroscopio utilizando un micro-cuchillo (Tabla 1), y colocar esta en una de las hojas (Figura 2A4 y las Figuras 2B y C). Esto evita el cierre completo del clip y crea dimensiones estandarizadas de compresión. Cuando el clip se cierra la distancia interblade es de aproximadamente 230 micras. Hacer un nuevo tapón para cada experimento como el material de polietileno puede comprimir durante su uso, lo que alteraría el espacio interblade. Nota: La tensión del resorte de la pinza disminuye con el tiempo de tal manera que después de aproximadamente 80 compresiones el clip ya no se cierra totalmente al tapón y necesita ser reemplazado. 3. Preparación antes de la cirugía Coloque el ratón en la cámara de sueño (Figura 1) e iniciar la anestesia con isoflurano al 4% (Figura 2A5 </strong>) Vaporizado en oxígeno puro, usando un vaporizador (Figura 2A3 y en la Tabla 1). Pruebe el reflejo de retirada del ratón suavemente pellizcando la red de la piel entre los dedos de los pies con unas finas pinzas de plástico. Haga esto con cuidado ya que los ratones recién nacidos se lesionan con facilidad. Pellizcos resultados demasiado duras en hematomas inmediata. La realización de esta prueba en el inicio de la sedación desencadena el reflejo y proporciona una buena indicación de la cantidad de fuerza necesaria. Una vez que se abolió el reflejo, retire el ratón de la cámara de sueño y colocarlo en una posición boca abajo en la mesa de operaciones con el morro insertado en la máscara de la nariz que proporciona un suministro continuo de 4% de isoflurano mezclado en oxígeno puro (Figura 1). Asegúrese de que la almohadilla de calentamiento se enciende y se ajusta a 37-38 ° C, según la hipotermia durante la cirugía puede ser fatal. Para lograr una analgesia completa, inyecta por vía subcutánea 50 l de anestésico local bupivacaína (2,5 mg / ml, <strong> Figura 2A6) en el sitio de la cirugía (en los experimentos aquí, esto es a nivel torácico (T) 9-T11). Utilice una jeringa de insulina (300 l, 30 G, Figura 2A7 y Tabla 1) para realizar la inyección. Reducir la concentración de isoflurano entregado a la máscara de la nariz a un 1-2%. 4. La laminectomía dorsal Realizar la cirugía bajo control microscópico. Después de limpiar el área de la cirugía con gluconato de clorhexidina (Tabla 1 # 19) durante al menos 30 seg, hacer una incisión en la piel transversal 1-2 mm en T9-T11 usando un microknife (Figura 2A8). Nota: En los ratones ICR neonatal la parte rostral del estómago, visible cuando contiene leche, se enfrenta a los niveles vertebrales T12-T13 (Figura 3). Otro punto de referencia es la parte rostral del agregado de tejido adiposo subcutáneo torácico que termina en alrededor de T8-9. Este punto de referencia es visible sólo después de la incisión de la piel. <li> El uso de fórceps (Figura 2A9 y A10) para ensanchar la abertura de la piel en una dirección transversal a 8-9 mm tirando de la piel con suavidad rostral y caudal (la piel desgarra fácilmente, creando una herida liso y recto). Esto proporciona suficiente acceso lateral a la columna vertebral. Retraer los bordes de la incisión en la piel de las estructuras subyacentes mediante la inserción de piezas estériles de esponja de gelatina hemostática (Figura 2A11 y en la Tabla 1) por vía subcutánea rostral y caudal a la incisión. Esto agranda la abertura y evita que la piel se retraiga y oscureciendo la zona durante la cirugía. La esponja de gelatina hemostática no necesita ser remojados en solución salina antes de su uso. Para exponer la columna vertebral, disecar los músculos paravertebrales con unas tijeras finas (Figura 2A12 y la Tabla 1). Cortar las inserciones de los músculos de la columna vertebral y exponer la lámina (Figura 4A). NoE también que en esta etapa del proceso espinal es poco desarrollada. Identificar la línea media y cortar transversalmente entre las dos láminas (que en esta etapa es cartilaginoso) con unas tijeras finas (Figura 4B). Con cuidado, coloque una hoja de un fórceps fino entre la lámina y la duramadre (Figura 4C), sujete la lámina con las pinzas y tire de él con cuidado hasta que una pieza se rompe, dejando intacta la duramadre (Figura 4D). Repita esto 2-3 veces para obtener una larga laminectomía 1-2 segmento. Usando las pinzas finas como gubias, eliminar partes de las carillas articulares de forma bilateral para ganar espacio suficiente para colocar el clip dentro del canal vertebral. Limpiar la zona quirúrgica y controlar la hemorragia con pequeños trozos de esponja de gelatina hemostática. 5. Lesión de Médula Espinal Compresión Abrir el aneurisma de mini-clip modificado en el soporte de pinza (Figura 2A13 y la Figura 2B) y el lugar THe cuchillas en cada lado de la médula espinal en los espacios entre la faceta Las uniones y el cable. Asegúrese de que las cuchillas se insertan lo suficiente como para afectar a la parte ventral de la médula espinal. Si esto no es posible, eliminar más de las carillas articulares. Suelte el mini-pinza rápidamente, manteniéndolo en su lugar con el soporte de clip para evitar que se deslice. Mantener la compresión durante 15 s. Abrir el mini clip de forma rápida y eliminarlo. Para lograr una compresión simétrica, invertir la orientación de la mini-clip, y el uso de la marca fácilmente visto hecha por el edema hemorrágico de la primera compresión como guía, vuelva a colocar el clip en la orientación inversa para una segunda compresión de 15 segundos (antes experimento demostró que esto genera déficits histológicos y fisiológicos simétricas, mientras que las compresiones individuales no 1). La duramadre no debe ser dañado por la compresión. Limpiar la zona y mantener la hemostasis en trozos de esponja de gelatina hemostática. Retire las piezas de esponja de gelatina hemostática que fueron colocados debajo de los bordes de la incisión en la piel en el inicio de la cirugía y cerrar la incisión de la piel con 6,0 sutura estéril y un soporte de aguja (Figura 2A14 y 15). Inyectar por vía subcutánea 0,75 mg / kg de peso corporal de buprenorfina (Figura 2A16) diluido en PBS estéril usando una jeringa de insulina (300 l, 30 G). 6. Cuidado posoperatorio Retire el ratón de la máscara de la nariz y colocarlo en un conjunto de cámara de temperatura controlada a 30 ° C hasta que el efecto de la anestesia y el ratón se pone en alerta (1-3 horas es normalmente suficiente). Inyectar Diazepam (Figura 2B17) por vía intraperitoneal en la madre (8 g / kg de peso corporal). Esto crea un sopor que disminuye el riesgo de canibalismo durante la primera noche, cuando el riesgo es máximo. Devolver el ratón funciona a la basura. Si la camada es large (> 12 cachorros), eliminar algunas de las crías no operados, preferencialmente los animales más grandes si difieren en tamaño, para reducir la competencia por la leche. atención materna de los cachorros es mejor operados en la línea de ICR si el tamaño de la camada es de alrededor de 9 cachorros. Para el manejo del dolor, administrar buprenorfina (0,75 mg / kg de peso corporal) por vía subcutánea una vez al día durante los primeros días del postoperatorio, utilizando una jeringa de insulina (300 l, 30 g). Un volumen apropiado para inyección subcutánea es de 30-50 l. En la vocalización ratones recién nacidos y la agitación son buenos indicadores de dolor. Realizar un examen diario de los ratones lesionados utilizando una hoja de puntuación para evaluar la nutrición, el peso corporal, deshidratación, dolor, cicatrización de heridas, la retención de la orina y el estado de infección. De acuerdo con la puntuación obtenida, proporcionar cuidados especiales, tales como inyecciones de una solución estéril Nutrición Pediátrica (Tabla 1 # 18) en el caso de la nutrición anormal. La hoja de la cuenta también0; define los criterios de punto final humanas. Una madre que no rechaza los cachorros heridos es el mejor cuidador. En el caso poco común de disfunción de la vejiga, la vejiga realizar el masaje dos veces al día hasta que se restaure la función. Esto se hace colocando el ratón en una posición supina en una mano y masajear suavemente la parte inferior del abdomen en una dirección rostro-caudal usando la punta del dedo.

Representative Results

Lesión de la médula espinal de compresión y pérdida de función Como se ha descrito anteriormente, mediante la optimización de los procedimientos preoperatorios, quirúrgicos y postoperatorios, un modelo SCI de compresión reproducible en el ratón neonatal se puede obtener 1. El tapón de polietileno colocada en una hoja de la pinza (Figura 2B y C) impide el cierre completo de la pinza y mantiene la distancia entre hojas consistente en alrededor de 230 micras. La inversión de la orientación del clip en entre los dos resultados compresiones en una lesión simétrica, como se juzga por secuelas histológico (Figura 5A y 1). Inmediatamente después de la eliminación de mini-clip, el tejido de la médula espinal comprimida se vuelve más oscura debido a la contusión hemorrágica y edema. La observación de las secciones de serie de la médula espinal lesionada teñidas para la eosina y hematoxilina ya un día a lalesión espués revela deterioro gradual del tejido cuando se aproxima al epicentro de la lesión (Figura 5A). La presencia de cavidades intraespinal o sangre en la lesión no es inusual. Evaluación de comportamiento, por ejemplo mediante el seguimiento de las trayectorias de las patas traseras en condiciones no peso condiciones que llevan unas pocas horas después de la cirugía, muestra un deterioro dramático de la motilidad de las extremidades posteriores en ratones lesionados SCC en comparación con los ratones de control simulado en el que se lleva a cabo solamente una laminectomía (Figura 5B y 1) . Esta prueba se puede repetir hasta que el ratón es capaz de llevar a cabo otras pruebas de comportamiento que requieren que llevan su propio peso 1. La mortalidad y la recuperación después de la cirugía la mortalidad intraoperatoria se debe principalmente a la apnea y paro cardíaco causado por la alta concentración de isoflurano necesaria para alcanzar la suficiente anesthesia. Presentación de la anestesia La bupivacaína local en el protocolo quirúrgico permite la reducción de la concentración de isoflurano y por lo tanto disminuye significativamente la tasa de mortalidad. En una serie experimental reciente que incluye más de 20 animales, la mortalidad intraoperatoria fue nula. Por el contrario, la supervivencia postoperatoria está influenciado principalmente por la aceptación de los ratones operados por su madre. Una mejora significativa se produjo cuando la ansiedad y la agresividad se redujo mediante la entrega de una única inyección de diazepam (ip 8 g / kg de peso corporal) a la madre antes de regresar a los ratones operados de la camada 1. La aceptación y la recuperación postoperatoria de los ratones operados pueden ser monitoreados por la presencia de la leche en el estómago. El estómago de un ratón P1-P7 que tiene la leche borracho es claramente visible a través de blanco y la piel abdominal (Figura 3). Comparación de la alimentación en operada, simulacro de control y los ratones no operado es útil para evaluar el estado nutricional de lesionarratones d. Evaluar el crecimiento de accionamiento frente a ratones no operado muestra que a pesar de un poco de pérdida de peso durante el primer día post-operatorio, la curva de crecimiento de los ratones operados normaliza rápidamente a partir de entonces (Figura 6). La mortalidad relacionada con la disfunción de la vejiga o infección no se observó incluso en los ratones estudiados por hasta 7 semanas. Número en la Fig. 2 Nombre Fabricante / Proveedor Referencia # Enlazar Comentario 1 jeringa de plástico (30 o 50 ml) 2 placa de Petri de plástico (150 x 25 mm) 3 vaporizador de isoflurano Fortec Cypranordeste http://www.mssmedical.co.uk/products/new-vaporisers/ Nos usar y dispositivo antiguo de la producción, comprobamos el enlace para más nuevo dispositivo 4a Yasargil aneurisma temporal de mini-clip Aesculap FE681K http://www.aesculapusa.com/assets/base/doc/DOC697_Rev_C-Yasargil_Aneurysm_Clip.pdf 4b Fine orificio capilar de polietileno Identificación tubo 0,58 mm, 0,96 mm OD Smiths Medical 800/100/200 http://www.smiths-medical.com/industrialproducts/8/39/ 5 Isoflurano (Forene) Abbott GmbH & Co. KG http://www.life-sciences-europe.com/product/forene-abbott-gmbh-wiesbaden-group-narcotic-germany-west-2001-1858.html 6 Marcain (bupivacaína) AstraZeneca http://www.astrazeneca.co.uk/medicines01/neuroscience/Product/marcaine 7 jeringa de insulina de 0,3 ml 30 G x 8mm VWR 80086-442 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4646138 8 borde de corte de 5 mm Fine Micro cuchillo Ultra Fine Science Tools 10315-12 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp= Kat y suchkatalog = 0019900000 y reloadmenu = 1 9 Adicionales pinzas finas Graefe – 0,5 mm Tip Fine Science Tools 1153-1110 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp= Kat y suchkatalog = 0055700000 y reloadmenu = 1 En realidad, no es necesario, a menudo los dientes son demasiado grandes <td> 10 Fórceps recto Supergrip Fine Science Tools 00632-11 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp= Kat y suchkatalog = 0053500000 y reloadmenu = 1 Dos pinzas son necesarias 11 Spongostan Especial 70 x 50 x 1 mm Ferrosan 12 Vannas Spring Tijeras – 2 mm hojas rectas Fine Science Tools 15000-03 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp= Kat y suchkatalog = 0012800000 y reloadmenu = 1 13 La aplicación de fórceps Vario Clip Aesculap FE502T http://www.aesculapusa.com/assets/base/doc/DOC697_Rev_C-Yasargil_Aneurysm_Clip.pdf 14 Vicryl 6-; 0 (Ethicon) Johnson y Johnson J105G 15 porta-agujas micro Diethrich 11-510-20 http://trimed-ltd.com/Products/Suture-Instruments/Micro-Needle-Holders-With-Tungsten-Carbide-Inserts/Ref-11-29.html dieciséis Temgesic (buprenorfina) Schering-Plough 17 Stesolid (diazepam) Actavis También conocido como Valium 18 Pedamix Fresenius Kabi http://www.helsebiblioteket.no/retningslinjer/pediatri/mage-tarm-lever-ernring/parenteral-ernring 19 Klorhexidinsprit (gluconato de clorhexidina) Fresenius Kabi D08A C02 http://www.felleskatalogen.no/medisin/klorhexidinsprit-fresenius-kabi-klorhexidinsprit-farget-fresenius-kabi-fresenius-kabi-560639 Tabla 1. Lista de herramientas y equipos para la generación de una lesión en la compresión de la médula espinal clip-conducido en un ratón neonatal. Figura 1. Esquema de la configuración de la anestesia. Este esquema presenta la configuración de la anestesia diseñada para el ratón neonatal, con una cámara de sueño durante la anestesia inicial y un dispositivo de máscara de la nariz para la anestesia continua durante la cirugía. Figura 2. Principales herramientas y pinza de compresión. (A) Las herramientas utilizadas durante el procedimiento. Los números corresponden a la anotación utilizada en la Tabla 1. (B y C) Un aneurisma temporal mini-clip de Yasargil con la punta de cada hoja recortado manualmente hasta aproximadamente 150 micras de espesor. Un tapón hecho de un trozo de tubo de polietileno (Tabla 1) se coloca en una de las cuchillas para evitar el cierre completo de la pinza. Barra de escala: 2 mm. Aplicación: aplicador de pinzas (# 12 en A); St:. Tapón Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3. Punto de referencia para la evaluación preoperatoria de nivel espinal en ratón ICR neonatal. (A) Vista lateral de un ratón ICR P1 con leche blanca en los s coincidir. La parte rostral del estómago corresponde a T12-T13 nivel espinal. (B) del ratón P1 ICR bajo anestesia en una posición de decúbito prono. Aunque más difícil de visualizar que en (A), el estómago lleno de leche es reconocible. La parte rostral del estómago indica T12-T13 nivel espinal. Barras de escala: 0,5 cm. Figura 4. dorsal laminectomía. (A) Disección de los músculos paravertebrales. Tenga en cuenta que a esta edad el proceso espinal es poco desarrollada. (B) de corte transversal de la lámina con unas tijeras finas. (C) La introducción de una pala de una delgada fórceps entre la lámina y la dura. El punto de entrada se muestra por la punta de flecha. (D) La eliminación de la lámina. Barra de escala: 2 mm. archivos / ftp_upload / 53498 / 53498fig5.jpg "/> Figura 5. histológico y resultados del comportamiento después de una lesión por compresión de la médula espinal en P1. (A) eosina y hematoxilina tinción en las secciones de la médula espinal de un ratón lesionada (1 día después de la lesión) a una distancia diferente del epicentro lesión. (B) restos representativos de las extremidades anteriores y miembros posteriores trayectorias observó 6 horas después de la lesión o después de una laminectomía control simulado. Rastros en la parte superior representan trayectorias, desde una vista lateral del animal. Las huellas de la parte inferior representan trayectorias vistos desde el aspecto ventral del animal. Ver también 1. Barra de escala: 250 micras. DH: asta dorsal; L, izquierda; R: right; SCC: compresión de la médula espinal; VH:. Asta ventral Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt = "Figura 6" src = "/ files / ftp_upload / 53498 / 53498fig6.jpg" /> Figura 6. curvas de crecimiento Comparativos. Histograma que muestra el aumento de peso de los ratones lesionados no operado y SCC de día postnatal 1 a día postnatal 9.

Discussion

En este artículo se describen los procedimientos para una lesión generada clip-SCC en ratones P1. Los mismos procedimientos se pueden también realizar en etapas posteriores. Lesiones de compresión se realizaron con éxito en P5, P7, P9 y P12 (Züchner, et al., Manuscrito en preparación). En todas las etapas postnatales, la anestesia general se obtiene con isoflurano vaporizado en oxígeno puro, pero la calidad de la anestesia depende en gran medida de la edad. En intentos iniciales de P1-P4, antes de la anestesia local, se introdujo en el protocolo, era difícil obtener una sedación profunda y prolongada debido a una ventana de dosis-efecto estrecho entre la sedación insuficiente y sobredosis. Además, las preocupaciones relacionadas con un efecto neurotóxico de isoflurano en animales recién nacidos se han planteado 27-30. Una combinación de isoflurano y los resultados anestésico local de bupivacaína en una anestesia más profunda y más estable, mientras que permitan una reducción de la dosis de isoflurano en un factor de 2-3. Los diferentes tipos de anesthesia se han descrito para los roedores neonatales, incluyendo crioanestesia 31,32, pero un inconveniente potencial de crioanestesia es su efecto neuroprotector (revisado por 33,34), lo que podría complicar la generación de una lesión eficiente y reproducible. La anestesia basada en barbitúrico se considera que tiene una menor eficiencia en ratones recién nacidos debido a los niveles más bajos de albúmina sérica y la grasa corporal que en los adultos 35,36.

Aunque es bastante invasiva y traumática, una vez que el procedimiento se estableció la tasa de mortalidad durante la cirugía es baja. Sin embargo, hay pasos críticos durante el procedimiento que requieren especial atención para mejorar la recuperación y supervivencia de los ratones operados. Una cuestión importante es seleccionar cachorros que tendrán la mejor oportunidad de sobrevivir a la cirugía. Cuando la camada es grande el estado nutricional de las crías individuales varía. Además de la hemorragia inevitable que se produce durante la cirugía, los cachorros operados pasan horass lejos de la madre, y que a menudo no toman leche antes de la mañana siguiente. Por lo tanto, es una ventaja para seleccionar cachorros que ya tienen una cierta cantidad de leche en el estómago. Esto es fácilmente visible a través de la piel abdominal de P0 a P7.

Durante la primera noche, el cachorro es operada en un gran riesgo de ser canibalizado por la madre. Durante el desarrollo inicial de este modelo más de la mitad de los ratones operados faltaban a la mañana siguiente, con claros signos de sangre en la jaula. Necrofagia, el canibalismo y el infanticidio en los roedores se han estudiado durante décadas 37-40. En este estudio, el canibalismo sólo era testigo de una vez, pero se consideró una explicación más probable de necrofagia porque los cachorros que fueron devueltos a la jaula eran por lo general en tan buena forma que la muerte por causas naturales durante la noche parecía improbable. Esto llevó a la idea de utilizar un agente farmacológico reversible, como el diazepam para reducir la ansiedad y la agresividad in la madre (revisado por 41). La inyección intraperitoneal de Diazepam mejorado en gran medida la situación, dejando caer la mortalidad durante la primera noche de más de 60% a menos del 20%.

La reducción de tamaño de la camada, tras el sacrificio y perturbar la camada tan poco como sea posible después de la recuperación postoperatoria son elementos adicionales que pueden beneficiar a los animales operados. Sin embargo, dejando solamente las crías operados con la madre no es beneficioso. El mejor equilibrio de las crías no operadas operadas / puede variar de acuerdo a la línea, pero para ratones ICR y SCID-ICR dejando 4-5 cachorros operados (lesión o tratamiento simulado) en conjunto con 3-4 crías no operados dio los mejores resultados.

En un sentido general, la limitación principal de este modelo SCI neonatal es que la médula espinal neonatal difiere en muchos aspectos de la médula espinal del adulto, y por lo tanto pueden no proporcionar resultados experimentales que son comparables a los obtenidos a partir de modelos SCI adultos. Tales diferencias incluyen el tamaño general yvolumen de la médula espinal, el número de células, la infrarrepresentación de determinados tipos de células tales como oligodendrocitos, las respuestas inmunes inmaduros y circuitos neuronales inmaduras. Por lo tanto, las conclusiones extraídas de los experimentos en este modelo deben ser considerados cuidadosamente. Por otro lado, el modelo es relevante para el escenario relativamente menos investigado de SCI pediátrica. Por otra parte, la debilidad evidente con respecto a los modelos SCI adultos es también una fuerza potencial ya que puede permitir el esclarecimiento de los mecanismos de plasticidad que, aunque mínimamente existente en la médula espinal del adulto, podrían representar un sustrato terapéutico si reintegrados. Es concebible que el restablecimiento de las condiciones neonatales o incluso embrionarias podría ser implementado a través de la implantación de células o tejidos menos desarrollados o por tratamiento con reactivos que generan el tejido adulto con las características anteriores del desarrollo. El uso de enzimas para eliminar las redes perineuronales es un ejemplo de este último enfoque 42,43.

<p class="Jove_content"> Una cuestión importante al establecer un modelo animal para el SCI es la obtención de una lesión estandarizada. Este es un aspecto importante que se ha tratado en múltiples modelos SCI, por ejemplo, la transección, hemisección, impactadores, compresión con balón, aplastar con fórceps, compresión peso estático, etc. En lo que respecta a los dispositivos de impacto, los esfuerzos en esta dirección han dado lugar a modelos SCI en roedores adultos que múltiples parámetros de impacto, como la velocidad, la fuerza y la duración pueden ser manipulados (revisado por 44). Otro enfoque, que implica menos equipo, emplea una modificación de la pinza de aneurisma Kerr-Lougheed 45,46. Estos 2 enfoques son complementarios como el impactador imita una lesión por contusión mientras que los imitadores de clip de una lesión por compresión con un cierto grado de isquemia concurrente. Debido a las limitaciones de tamaño considerable y una mayor vulnerabilidad de los ratones recién nacidos, la mayor mortalidad asociada con el tiempo quirúrgico, así como los costos de desarrollo de equipos de menor escala, se optó por desarrollar una compresión generada clip-en lugar de un enfoque contusión generada impactador. Esto se logró mediante la adaptación de un aneurisma de mini-clip disponible en el mercado para acomodar el tamaño de la columna vertebral de ratones recién nacidos 1. Adición de un tapón garantiza un ancho de compresión estandarizado, y siempre que la tensión de la pinza comprime hasta el límite del tapón, la fuerza de la compresión durante la fase estática en anchura mínima debe variar poco. Lo que no ha sido estandarizada es la velocidad de la compresión durante su fase dinámica, ya que esto puede variar a medida que cambia clip de tensión durante su vida útil. Como la fase estática de la compresión dura mucho más que la fase dinámica, y hay poco para sugerir que el tejido de la médula espinal ejerce gran parte de una contrafuerza contra las cuchillas de mini-clips, es probable que la gravedad de la lesión es más dependiente de la fase estática. Esto, sin embargo, aún no se ha probado. Lesióngravedad es probable que dependa de varios factores, incluyendo la fuerza estática de compresión y la duración, la velocidad de compresión y descompresión, la posición de la mini-clip, y el número de compresiones realizadas en el mismo sitio. Por lo tanto, la variación combinatoria de estos parámetros podría resultar en la generación de un espectro de gravedad de lesiones de débil a severa. A pesar del potencial de variabilidad, en nuestro estudio publicado anteriormente 1 se obtuvieron resultados consistentes en histológico, los niveles fisiológicos y de comportamiento, por lo que hay poco que sugiera que la normalización aceptable es difícil de lograr. Observamos que en ese estudio hemos utilizado varios métodos de validación en cada nivel, incluyendo pruebas de comportamiento tales como aire paso a paso como se muestra en la Figura 5.

En este modelo SCI neonatal la lesión ahorra una cierta proporción de los axones y de ese modo proporciona una situación favorable para la obtención de la plasticidad de adaptación a través de la re-modeling de conexiones ahorrado y la formación de nuevos circuitos. Además, como el ratón neonatal es muy adecuado para la investigación por muchos métodos experimentales, es posible utilizar este modelo para estudiar la recuperación funcional y la plasticidad adaptativa con un enfoque integrador, incluyendo pruebas de comportamiento, la localización axonal retrógrado y anterógrado, inmunohistoquímica, electrofisiología y alto de grabación óptica -throughput 1. A modo de ejemplo, tomamos ventaja de este enfoque integrador para demostrar red de remodelación en el nivel de las entradas descendente específicos utilizando imágenes de calcio de alto rendimiento en la ex vivo preparaciones wholemount del tronco del encéfalo y la médula espinal lesionada 1. Esto puede ser empujado aún más mediante el uso de herramientas de neuro-optogenético y farmacología optogenético para evaluar la remodelación de las conexiones sinápticas entre las subpoblaciones específicas de neuronas de la médula.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work has been supported by grants from the South-Eastern Norway Regional Health Authority (JLB, 2014119; JCG, project numbers 2015045 and 2012065), by the Norwegian Research Council (JCG, project number 23 00 00) and the University of Oslo.

Materials

Plastic seringe (30 or 50 mL)
Plastic petri dish (150x25mm)
Fortec isoflurane vaporizer Cyprane We use and old device out of production, check the link for newer device
Yasargil temporary aneurysm mini-clip Æsculap FE681K
Fine -Bore Polyethylene tubing ID 0.58mm, OD 0.96mm Smiths Medical 800/100/200
Isoflurane (Forene) Abbott GmbH & Co. KG
Marcain (Bupivacain) AstraZeneca
Insuline seringe 0.3ml 30Gx8mm VWR 80086-442
Ultra Fine Micro Knife 5mm cutting edge Fine Science Tools 10315-12
Extra Fine Graefe Forceps – 0.5mm Tip Fine Science Tools 1153-10 Not really necessary, often the teeth are too large
Forceps SuperGrip Straight Fine Science Tools 00632-11 Two forceps are necessary
Spongostan Special 70 x 50 x 1 mm Ferrosan
Vannas Spring Scissors – 2mm Blades Straight Fine Science Tools 15000-03
Vario Clip Applying Forceps Aesculap FE502T
Vicryl 6–0 (Ethicon) Johnson and Johnson J105G
Diethrich micro needle holder 11-510-20
Temgesic (buprenorphine) Schering-Plough
Stesolid (diazepam) Actavis Also known as Valium
Pedamix Fresenius Kabi
Klorhexidinsprit (chlorhexidine gluconate) Fresenius Kabi D08A C02
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Züchner, M., Glover, J. C., Boulland, J. A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model. J. Vis. Exp. (109), e53498, doi:10.3791/53498 (2016).
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