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Medicina

Ein Neonatal Maus Spinal Cord Injury Kompression Modell

Published: March 27, 2016
doi:
10.3791/53498
, ,
1Department of Neurosurgery,Oslo University Hospital, 2Norwegian Center for Stem Cell Research,Oslo University Hospital, 3Laboratory of Neural Development and Optical Recording (NDEVOR), Department of Physiology, Institute of Basic Medical Sciences,University of Oslo

Summary

This article describes a method for generating a reproducible spinal cord compression injury (SCI) in the neonatal mouse. The model provides an advantageous platform for studying mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous functional recovery.

Abstract

Rückenmarksverletzung (SCI) verursacht typischerweise verheerende neurologische Defizite, insbesondere durch Schäden an Fasern vom Gehirn zum Rückenmark absteigender Reihenfolge. Eine wichtige aktuelle Forschungsgebiet ist über die Mechanismen der adaptiven Plastizität konzentriert, die spontane oder induzierte funktionelle Erholung nach SCI zugrunde liegen. Spontane funktionelle Erholung wird berichtet, größer früh im Leben zu sein, die Erhöhung interessante Fragen darüber, wie adaptive Plastizität Veränderungen wie das Rückenmark entwickelt. Zur Erleichterung der Untersuchung dieser Dynamik haben wir ein SCI-Modell in der Neugeborenen-Maus entwickelt. Das Modell hat Relevanz für die pädiatrische SCI, die zu wenig untersucht. Da neuronale Plastizität im adulten einige der gleichen Mechanismen wie neuronale Plastizität im frühen Leben beinhaltet 1 kann dieses Modell möglicherweise eine gewisse Bedeutung haben auch für Erwachsene SCI. Hier haben wir das gesamte Verfahren zur Erzeugung eines reproduzierbaren Kompression des Rückenmarks (SCC) Verletzung in der Neugeborenen-Maus beschreibenBereits nach der Geburt (P) Tag 1. SCC durch die Durchführung einer Laminektomie bei einer gegebenen spinaler Ebene erreicht ist (hier bei Brust-Ebenen 9-11 beschrieben) und dann ein modifiziertes Yasargil Aneurysma Miniclip schnell zum Komprimieren und Dekomprimieren das Rückenmark . Wie bereits beschrieben, kann die verletzte neugeborenen Mäusen für Verhaltensdefizite getestet werden oder 1 für ex vivo physiologische Analyse der synaptischen Konnektivität unter Verwendung von elektrophysiologischen und Hochdurchsatz – optischen Aufzeichnungstechniken geopfert. Frühere und laufende Studien verhaltensmäßigen und physiologischen Beurteilung verwendet haben eine dramatische, akute Beeinträchtigung der hindlimb Motilität nachgewiesen durch eine vollständige funktionelle Wiederherstellung innerhalb von 2 Wochen gefolgt, und die ersten Anzeichen für Veränderungen in der Funktionsschaltung auf der Ebene der identifizierten absteigend synaptischen Verbindungen 1.

Introduction

During the last decade, increasing evidence obtained from different spinal cord injury (SCI) models has shown that spinal networks can reorganize spontaneously to contribute to functional recovery1-9. Adaptive plasticity has as a consequence become an important topic in SCI research. It has been shown that plasticity encompasses regrowth of spared axons, sprouting of new axon collaterals and the formation of novel synaptic connections. Much of this knowledge has been obtained from behavioral or anatomical studies in adult animals. An important limitation of adult spinal cord studies is the difficulty of performing high-throughput physiological assessment, which is easier in neonatal preparations1. One major difference is that wholemount ex vivo preparations of the adult brainstem and spinal cord have low viability. Another is that adult spinal tissue is more opaque to light because it is thicker and myelinated. Although recent advances in in vivo imaging (see for example, 10-12) may partially overcome these problems, the possibility of performing high throughput imaging at any desired dorsoventral depth at multiple sites along a given brainstem-spinal cord preparation is currently only feasible in neonates. The immature state of axon myelination in the neonatal spinal cord facilitates high-throughput ex vivo optical recording, thus permitting a dynamic assessment of functional synaptic connections13-17. Combined with genetically encoded calcium reporters and optogenetic stimulation and pharmacology tools, optical approaches can contribute to a deeper understanding of the mechanisms underlying adaptive plasticity.

It is estimated that between 1-10% of all spinal cord injuries affect infants and children18-22. In contrast to adult SCI the pathogenesis and potential for spontaneous recovery in pediatric SCI is less studied. Using a neonatal SCI model can therefore provide more insight into pediatric SCI and contribute to a better understanding of the pathogenetic and recovery mechanisms involved. Moreover, post-SCI plasticity supporting functional recovery in the adult spinal cord is believed to involve at least in part the same mechanisms that govern the development of the central nervous system such as axon growth, branching and formation of new synapses23-26. Thus, using a neonatal SCI model could provide important insights into mechanisms that are also operative in the adult spinal cord, or that could potentially be reinstated in the adult spinal cord (for example by implantation of fetal cells or tissue or of tissue constructed de novo from pluripotent stem cells) to facilitate recovery.

The neonatal mouse thus provides a platform for an integrative, multi-methodological approach to investigating adaptive plasticity following spinal cord injury, in which a combination of behavioral, physiological, anatomical, molecular and genetic methods can be readily employed. Establishing standardized neonatal injury models is an important step in implementing such studies.

Protocol

Dieses experimentelle Protokoll wurde von der National Animal Research Authority in Norwegen (Forsøksdyrutvalget, lokale experimentelle Zulassungsnummer 12,4591) in Übereinstimmung mit der Europäischen Union Tierschutzvorschriften (Federation European Laboratory Animal Science Association) zugelassen. Es wurden Anstrengungen unternommen, die Anzahl der Tiere zu minimieren verwendet und ihr Leiden. In diesem Artikel wird die Prozedur auf die postnatale (P) Tag 1 Wildtyp-ICR (Imprinting Kontrolle Region) Mäuse (Jackson, USA) verwendet wird, beschrieben, aber die gleiche Ansatz kann auch in späteren Phasen verwendet werden. 1. Konstruktion eines Gas Anesthesia System for Neonatal Mice (Abbildung 1) Erstellen Sie eine Nasenmaske von der Spitze einer Spritze. Schließen Sie diese an die 3-Wege – Hahn mit Kunststoffschlauch (Abbildung 1 – rote Schläuche und Abbildung 2A1). Bohren Sie ein kleines Loch in der Seite der Nasenmaske und verbinden Sie diesen mit Kunststoffschlauch den Überlauf von Gas aus dem zu entfernen,Maske. Beenden Sie den Schlauch entweder mit einer Vakuumpumpe für einen leichten Unterdruck gesetzt, oder in einer Abzugshaube (Abbildung 1 – hellgrün Schläuche). Machen Sie eine Anästhesie Kammer von einer 150 mm x 25 mm Kunststoff – Petrischale (Abbildung 2A2). Auf der einen Seite ein Loch groß genug, um den Kopf der Maus und die Nasenmaske aufzunehmen. Auf der gegenüberliegenden Seite, stellen zwei kleinere Löcher , durch welche die Kunststoffrohre zu und von der Nasenmaske (1 – roten und grünen hellen Schlauch bezeichnet) eingesetzt werden kann. Machen Sie ein drittes Loch auf der Oberseite des Deckels und heften sich an diese eine dritte Kunststoffrohr , das an der Vakuumpumpe endet (Abbildung 1 – dunkelgrüne Schlauch). Der Zweck dieses dritten Rohr ist, um sicherzustellen, daß überschüssiges Gas, das durch den Auslass aus der Nasenmaske nicht entfernt wird eingefangen hat. Bauen Sie eine Schlafkammer, die durch ein Loch in der Unterseite jeder Art von Laborschale zu machen, die zu c groß genug ist,ontain der Maus und hat eine glatte und gleichmäßige Rand (die Öffnung der Schale ist mit dem Tisch bündig liegen Leckage von Gas zu verhindern). Schließen Sie das Loch in der Kammer an die 3-Wege – Hahn mit Kunststoffschlauch (Abbildung 1 – braun Schläuche). Platzieren Sie den Schlafraum unter einer Abzugshaube. Schließen Sie ein 3-Wege – Hahn mit dem Auslaufrohr aus dem Verdampfer (Abbildung 1 – gelbe Schläuche und Abbildung 2A3). Schließen Sie den Einlass des Verdampfers zur Sauerstoffversorgung (Abbildung 1 – blaue Schläuche). 2. Änderung eines Yasargil Temporäre Aneurysma Mini-Clip, um das Kompressionswerkzeug zu erstellen (Abbildung 2 und Tabelle 1) Bringen Sie den Clip fest an einem Ständer mit einer Klemme. Feilen Sie eine Binokularlupe zur visuellen Kontrolle verwenden, werden die Außenfläche der Spitze jedes Clips Klinge auf eine endgültige Dicke von etwa 150 um einen Schleifstein mit montiert auf einem Bohrer (2B und C). </li> Machen Sie einen Anschlag für den Clip durch ein kurzes Stück aus Polyethylen Kapillarschlauch (Tabelle 1) unter einem Stereomikroskop Schneiden eines Mikromesser (Tabelle 1), und legen Sie diese auf einem der Blätter (Abbildung 2A4 und 2B und C). Dies verhindert, dass ein vollständiges Schließen des Clips und schafft standardisierte Kompressions Dimensionen. Wenn der Clip die Zwischenschaufel Abstand geschlossen wird, beträgt etwa 230 & mgr; m. Machen Sie einen neuen Stopper für jedes Experiment als Polyethylenmaterial kann während des Gebrauchs zu komprimieren, die den Zwischenschaufel Raum verändern würde. Hinweis: Die Federspannung des Clips verringert im Laufe der Zeit, so dass die Klammer nicht mehr nach ca. 80 Kompressionen vollständig auf den Stopfen geschlossen, und muss ersetzt werden. 3. Vorbereitung vor der Operation Platzieren Sie die Maus in die Schlafkammer (Abbildung 1) und initiieren Anästhesie mit 4% Isofluran (Abbildung 2A5 </strong>) In reinem Sauerstoff verdampft, einen Verdampfer (Abbildung 2A3 und Tabelle 1). Testen Sie den Rückzug Reflex der Maus, indem Sie vorsichtig das Netz der Haut zwischen den Zehen mit einer dünnen Plastikzange einklemmen. Tun Sie dies sorgfältig, wie neugeborene Mäuse leicht verletzt. Kneifen zu hart Ergebnisse in unmittelbarer Quetschungen. Durchführung dieser Prüfung zu Beginn der Sedierung löst den Reflex und liefert einen guten Hinweis auf die Menge an Kraft, die notwendig. Sobald der Reflex abgeschafft wird, entfernen Sie die Maus aus dem Schlafraum und legen Sie sie in Bauchlage auf dem OP – Tisch mit der Schnauze in die Nase Maske eingefügt , die in reinem Sauerstoff (Abbildung 1) gemischt , um eine kontinuierliche Versorgung mit 4% Isofluran zur Verfügung stellt. Stellen Sie sicher, dass die Erwärmung Pad eingeschaltet und auf 37-38 ° C als Hypothermie während der Operation kann tödlich sein. Zur Erzielung vollständige Analgesie injizieren subkutan 50 & mgr; l des Lokalanästhetikums Bupivacain (2,5 mg / ml, <strong> Abbildung 2A6) an der Stelle der Operation (in den hier gezeigten Experimenten, dies bei thorakalen (T) 9-T11). Verwenden einer Insulinspritze (300 & mgr; l, 30 G, Figur 2A7 und Tabelle 1) , um die Injektion durchzuführen. Reduzieren Sie die Isofluran-Konzentration auf die Nasenmaske geliefert 1-2%. 4. dorsale Laminektomie Führen Operation unter mikroskopischer Kontrolle. Nach der Reinigung des OP – Bereich mit Chlorhexidingluconat (Tabelle 1 # 19) für mindestens 30 Sekunden, machen Sie eine 1-2 mm Querhautschnitt bei T9-T11 mit einem microknife (Abbildung 2A8). Hinweis: Bei ICR neugeborenen Mäusen die rostralen Teil des Magens, sichtbar , wenn es enthält Milch, ist mit Blick auf die Wirbelstufen T12-T13 (Abbildung 3). Ein weiterer Meilenstein ist die rostralen Teil des Brust subkutanen Fettgewebe Aggregat, das bei etwa T8-9 endet. Dieser Meilenstein ist nur sichtbar nach Hautschnitt. <li> Verwenden einer Pinzette (Abbildung 2A9 und A10) , um die Hautöffnung in Querrichtung durch Ziehen der Haut auf 8-9 mm zu verbreitern sanft rostral und kaudal (die Haut reißt leicht, einen glatten und geraden Wunde). Dies sorgt für eine ausreichende seitliche Zugang zur Wirbelsäule. Ziehen sich die Ränder der Inzision von darunterliegenden Strukturen durch Einfügen sterile Stücke von hämostatischen Gelatineschwamm (Abbildung 2A11 und Tabelle 1) subkutan rostral und kaudal der Inzision. Dadurch vergrößert sich die Öffnung und verhindert, dass die Haut zurückzieht und den Bereich während der Operation verschleiern. Die hämostatische Gelatineschwamm muss nicht vor der Verwendung in Kochsalzlösung eingeweicht werden. Um die Wirbelsäule entlarven, sezieren die paravertebralen Muskeln mit dünnen Schere (Abbildung 2A12 und Tabelle 1). Schneiden Sie die Befestigungen der Muskeln an der Wirbelsäule und setzen die Lamina (4A). Nichte auch, dass das Rücken Prozess in dieser Phase ist wenig entwickelt. Identifizieren Sie die Mittellinie und quer geschnitten zwischen den beiden Schichten (die in diesem Stadium knorpeligen ist) mit dünnen Schere (4B). Sorgfältig eine Klinge aus einer dünnen Zange zwischen der Lamina und der Dura (4C) zu platzieren, die Lamina mit der Pinzette greifen und heben vorsichtig nach oben , bis ein Stück weg bricht, intakt die Dura verlassen (4D). Wiederholen Sie diesen Vorgang 2-3 mal 1-2 Segment lange Laminektomie zu erhalten. Unter Verwendung der dünnen Zange als rongeurs, entfernen Sie Teile der Facettengelenke bilateral genug Raum zu platzieren Sie den Clip in den Wirbelkanal zu gewinnen. Reinigen Sie den OP-Bereich und steuern mit kleinen Stücken von hämostatischen Gelatineschwamm Blutungen. 5. Spinal Cord Injury Compression Öffnen Sie das modifizierte Aneurysma Mini-Clip in der Clip – Halterung (Abbildung 2A13 und 2B) und Platz the Klingen an jeder Seite des Rückenmarks in den Räumen zwischen den Facetten verbindet und der Schnur. Stellen Sie sicher, dass die Klingen tief genug eingesetzt werden, um die ventrale Teil des Rückenmarks zu beeinflussen. Wenn dies nicht möglich ist, mehrere der Facettengelenke entfernen. Lassen Sie die Mini-Clip schnell, es an Ort und Stelle mit dem Klammerhalter halten, damit sie nicht gleiten. Pflegen Sie die Komprimierung für 15 sek. Öffnen Sie den Mini-Clip schnell und entfernen. Um eine symmetrische Kompression zu erreichen, kehren die Ausrichtung des Miniclip, und mit Hilfe der leicht Marke durch die hämorrhagische Ödeme von der ersten Kompression als Führung aus gesehen, positionieren Sie den Clip in der umgekehrten Orientierung für eine zweite 15-sec-Kompression (vor Experiment zeigte , dass diese symmetrische histologische und physiologische Defizite erzeugt, während einzelne Kompressionen nicht 1). Die Dura sollte nicht durch die Kompression beschädigt werden. Reinigen Sie den Bereich und halten Hämostase mit Stücken von hämostatischen Gelatine Schwamm. Entfernen Sie die Stücke von hämostatischen Gelatineschwamm, der unter den Rändern der Hautschnitt zu Beginn der Operation platziert wurden und schließen Sie die Hautschnitt mit sterilem 6,0 Naht und einem Nadelhalter (Abbildung 2A14 und 15). Injizieren subkutan 0,75 mg / kg Körpergewicht Buprenorphin (Abbildung 2A16), verdünnt in sterilem PBS unter Verwendung einer Insulinspritze (300 & mgr; l, 30 g). 6. Nachsorge Entfernen Sie die Maus aus der Nase Maske und legen Sie sie in einer temperaturgeregelten Kammersatz bei 30 ° C, bis die Betäubung nachlässt und die Maus wird Alarm (1-3 Stunden ist in der Regel ausreichend). Injizieren Diazepam (Abbildung 2B17) intraperitoneal in die Mutter (8 g / kg Körpergewicht). Dies schafft eine torpor, die das Risiko von Kannibalismus in der ersten Nacht abnimmt, wenn dieses Risiko am höchsten ist. Bringen Sie den Betrieb der Maus auf den Wurf. Wenn der Wurf lARGE (> 12 Welpen), entfernen Sie einige der nicht operierten Welpen, bevorzugt die größeren Tiere, wenn sie in der Größe unterscheiden, Wettbewerb um die Milch zu reduzieren. Betreuung der Mutter der operierten Welpen ist am besten in der ICR-Linie, wenn die Wurfgröße um 9 Welpen ist. Zur Schmerzmanagement, verwalten Buprenorphin (0,75 mg / kg Körpergewicht) subkutan einmal täglich während der ersten postoperativen Tag, eine Insulinspritze (300 & mgr; l, 30 G). Ein geeignetes Volumen für die subkutane Injektion beträgt 30-50 ul. In neugeborenen Mäusen Stimmgebung und Agitation sind gute Indikatoren für Schmerzen. Führen Sie eine tägliche Untersuchung der verletzten Mäuse ein Notenblatt mit Ernährung zu bewerten, Körpergewicht, Dehydratation, Schmerz, Wundheilung, Harnverhalt und Infektionsstatus. Gemäß der Partitur erhalten werden , bieten besondere Sorgfalt, wie Injektionen einer sterilen pädiatrischen Ernährungslösung (Tabelle 1 # 18) im Falle eines anormalen Ernährung. Das Notenblatt auch0; definiert humane Endpunktkriterien. Eine Mutter, die nicht die verletzten Welpen nicht ablehnen ist der beste Betreuer. In dem ungewöhnlichen Fall von Blasenfunktionsstörungen, Blasen Massage zweimal täglich ausführen, bis Funktion wiederhergestellt wird. Dies geschieht, indem Sie die Maus in Rückenlage in einer Hand und massiert den Unterleib sanft in einem rostro-kaudal mit den Fingerspitzen getan.

Representative Results

Rückenmarkkompression Verletzung und der Verlust der Funktion Wie zuvor beschrieben, durch die präoperativen, chirurgischen und postoperativen Prozeduren Optimierung kann eine reproduzierbare Kompression SCI – Modell in der neonatalen Maus 1 erhalten werden. Das Polyethylen Stopper auf einer Klinge der Klammer platziert (2B und C) verhindert , dass die vollständige Schließung des Clips und hält den Zwischenklingenabstand konstant bei etwa 230 & mgr; m. Umkehren der Ausrichtung der Klammer zwischen den beiden Kompressionen führt zu einer symmetrischen Verletzung, wie durch histologische Folgeerscheinungen beurteilt (5A und 1). Unmittelbar nach dem Mini-Clip-Entfernung, das komprimierte Rückenmarksgewebe wird aufgrund hämorrhagischen Quetschung und Ödeme dunkler. Die Beobachtung der Serienschnitte des verletzten Rückenmarks gefärbt Eosin und Hämatoxylin schon eines Tages einfter Verletzung zeigt allmähliche Verschlechterung des Gewebes , wenn die Läsion Epizentrum (5A) nähert. Das Vorhandensein von Hohlräumen intraspinal oder Blut in die Läsion ist nicht ungewöhnlich. Verhaltensbeurteilung, beispielsweise durch hindlimb Trajektorien unter nicht-Gewicht Tracking Lagerbedingungen ein paar Stunden nach der Operation zeigt eine dramatische Verschlechterung der hindlimb Motilität bei SCC verletzten Mäuse im Vergleich zu Scheinkontrollmäuse , bei denen nur eine Laminektomie durchgeführt wird (5B und 1) . Dieser Test kann wiederholt werden , bis die Maus kann andere Verhaltenstests durchzuführen , die sein Eigengewicht 1 erfordern trägt. Die Mortalität und Genesung nach der Operation Die intraoperative Mortalität ist im Wesentlichen auf Apnoe und Herz durch die hohe Konzentration von Isofluran verursacht Verhaftung benötigt ausreichend anesthesi zu erreichenein. Einführung in das Lokalanästhetikum Bupivacain in das Operationsprotokoll ermöglicht eine Verringerung der Isofluran-Konzentration und damit verringert sich deutlich die Sterblichkeit. In einer aktuellen Versuchsreihe mit mehr als 20 Tieren war die intraoperative Mortalität gleich Null. Im Gegensatz dazu ist die postoperative Überleben vor allem durch die Annahme der operierten Mäuse von ihrer Mutter beeinflusst. Eine deutliche Verbesserung eingetreten , wenn die Angst und Aggressivität durch Abgabe einer einzigen Injektion von Diazepam (ip 8 g / kg Körpergewicht) an die Mutter vor der Rückkehr der operierten Mäuse auf den Wurf 1 reduziert wurde. Akzeptanz und postoperative Erholung der operierten Mäuse können durch die Gegenwart von Milch in den Magen überwacht werden. Der Magen eines P1-P7 Maus , die drunken Milch hat deutlich weiß und sichtbar durch die Bauchhaut (Abbildung 3). Vergleich der Fütterung in Betrieb, Scheinkontrolle und nicht operierten Mäusen ist nützlich für die Beurteilung des Ernährungsstatus von injured Mäusen. Bewertung der das Wachstum von betrieben gegenüber nicht operierten Mäusen zeigt , dass trotz eines kleinen Gewichtsverlust während der ersten postoperativen Tag, die Wachstumskurve der operierten Mäusen schnell danach (Abbildung 6) normalisiert. Die Sterblichkeit an Blasendysfunktion oder Infektionen im Zusammenhang wurde noch nie bei Mäusen beobachtet, so lange wie 7 Wochen untersucht. Anzahl in Abb. 2 Name Hersteller / Anbieter Referenz # Link Kommentar 1 Kunststoffspritze (30 oder 50 ml) 2 Kunststoff-Petrischale (150 x 25 mm) 3 Fortec Isofluran Verdampfer Cyprane http://www.mssmedical.co.uk/products/new-vaporisers/ Wir verwenden und alte Gerät aus der Produktion, überprüfen Sie den Link für neuere Gerät 4a Yasargil temporäre Aneurysma Mini-Clip Aesculap FE681K http://www.aesculapusa.com/assets/base/doc/DOC697_Rev_C-Yasargil_Aneurysm_Clip.pdf 4b Feine Bohrung Polyethylen Kapillarschlauchs ID 0,58 mm, AD 0,96 mm Smiths Medical 800/100/200 http://www.smiths-medical.com/industrialproducts/8/39/ 5 Isofluran (Forene) Abbott GmbH & Co. KG http://www.life-sciences-europe.com/product/forene-abbott-gmbh-wiesbaden-group-narcotic-germany-west-2001-1858.html 6 Marcain (Bupivacain) Zeneca http://www.astrazeneca.co.uk/medicines01/neuroscience/Product/marcaine 7 Insuline Spritze 0,3 ml 30 G x 8mm VWR 80086-442 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4646138 8 Ultrafein Micro Messer 5 mm Schneide Fine Science Tools 10315-12 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp= Kat & suchkatalog = 0019900000 & reloadmenu = 1 9 Extra Fine Graefe Pinzetten – 0,5 mm Spitze Fine Science Tools 1153-1110 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp= Kat & suchkatalog = 0055700000 & reloadmenu = 1 Nicht wirklich notwendig, die oft die Zähne sind zu groß <td> 10 Pinzetten Supergrip Gerade Fine Science Tools 00632-11 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp= Kat & suchkatalog = 0053500000 & reloadmenu = 1 Zwei Zangen sind notwendig 11 Spongostan Spezielle 70 x 50 x 1 mm Ferrosan 12 Vannas Frühling Schere – 2 mm-Klingen Fine Science Tools 15000-03 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp= Kat & suchkatalog = 0012800000 & reloadmenu = 1 13 Vario-Clip-Anlegezange Aesculap FE502T http://www.aesculapusa.com/assets/base/doc/DOC697_Rev_C-Yasargil_Aneurysm_Clip.pdf 14 Vicryl 6-; 0 (Ethicon) Johnson und Johnson J105G 15 Diethrich Mikro Nadelhalter 11-510-20 http://trimed-ltd.com/Products/Suture-Instruments/Micro-Needle-Holders-With-Tungsten-Carbide-Inserts/Ref-11-29.html 16 Temgesic (Buprenorphin) Schering-Plough 17 Stesolid (Diazepam) Actavis Auch bekannt als Valium 18 Pedamix Fresenius Kabi http://www.helsebiblioteket.no/retningslinjer/pediatri/mage-tarm-lever-ernring/parenteral-ernring 19 Klorhexidinsprit (Chlorhexidingluconat) Fresenius Kabi D08A C02 http://www.felleskatalogen.no/medisin/klorhexidinsprit-fresenius-kabi-klorhexidinsprit-farget-fresenius-kabi-fresenius-kabi-560639 Tabelle 1. Liste der Werkzeuge und Geräte zur Erzeugung eines Clips getriebenen Rückenmarkskompression Verletzung in einem neonatalen Maus. Abbildung 1. Schematische Darstellung der Anästhesie – Setup. Dieses Schema stellt die Anästhesie – Setup für die Neugeborenen – Maus entwickelt, mit einem Schlafraum für die anfängliche Anästhesie und einer Nasenmaske Vorrichtung zur Fortsetzung der Anästhesie während der Operation. Abbildung 2. Haupt Werkzeuge und Kompressionsclip. (A) Werkzeuge während des Verfahrens verwendet. Die Zahlen entsprechen der Anmerkung in Tabelle 1 verwendet wurde . (B und C) eine temporäre Yasargil Aneurysma mini-Clip mit der Spitze jedes Flügels bis etwa 150 & mgr; m Dicke manuell nach unten getrimmt. Ein Stopfen aus einem Stück Polyethylenschlauch (Tabelle 1) auf eine der Klingen platziert vollständigen Schließens des Clips verhindern. Maßstabsbalken: 2 mm. App: Clip-Applikator (# 12 in A); St:. Stopper Bitte hier klicken um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 3. Zeichen für die präoperative Beurteilung von spinaler Ebene bei der Neugeborenen – ICR – Maus. (A) Seitenansicht eines P1 ICR – Maus mit weißer Milch in den s tomach. Der rostrale Teil des Magens entspricht T12-T13 spinaler Ebene. (B) P1 ICR – Maus unter Anästhesie in Bauchlage. Obwohl schwieriger zu visualisieren, als in (A), der Magen mit Milch gefüllt ist erkennbar. Der rostrale Teil des Magens zeigt T12-T13 spinaler Ebene. Maßstabsbalken: 0,5 cm. Abbildung 4. dorsale Laminektomie. (A) Dissektion der paravertebralen Muskeln. Beachten Sie, dass das Rücken Prozess unterentwickelt in diesem Alter ist. (B) Transversale Schnitte der Lamina mit dünnen Schere. (C) Einführung einer Schaufel aus einer dünnen Zange zwischen der Lamina und der Dura. Der Eintrittspunkt wird durch die Pfeilspitze gezeigt. (D) Entfernen der Lamina. Maßstabsbalken: 2 mm. files / ftp_upload / 53498 / 53498fig5.jpg "/> Abbildung 5. Histologische und Verhaltensergebnisse nach Kompression des Rückenmarks Verletzung bei P1. (A) Eosin und Hämatoxylin – Färbung in Rückenmarksschnitten von einem verletzten Maus (1 Tag nach der Verletzung) in unterschiedlichem Abstand von der Verletzung Epizentrum. (B) Repräsentative Spuren von forelimb und hindlimb Trajektorien beobachtet 6 Stunden nach der Verletzung oder nach einer Scheinkontrolle Laminektomie. Spuren auf der Oberseite darstellen Trajektorien aus einer Seitenansicht des Tier betrachtet. Die Spuren am Boden darstellen Trajektorien von der ventralen Seite des Tieres angesehen. Siehe auch 1. Maßstabsbalken: 250 & mgr; m. DH: Hinterhorn; L, links; R: right; SCC: Kompression des Rückenmarks; VH:. Ventralhorn Bitte hier klicken um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt = "6" src = "/ files / ftp_upload / 53498 / 53498fig6.jpg" /> Abbildung 6. Vergleichende Wachstumskurven. Histogramm zeigt die Gewichtszunahme von nicht operierten und SCC verletzten Mäuse von postnatalen Tag 1 bis Tag nach der Geburt 9 zeigt.

Discussion

In diesem Artikel werden die Verfahren für einen Clip-generierte SCC Verletzung in P1 Mäusen beschrieben. Die gleichen Verfahren können auch in einem späteren Stadium durchgeführt werden. Kompression Verletzungen wurden erfolgreich auf P5, P7, P9 und P12 ausgeführt (Züchner, et al., Manuskript in Vorbereitung). Bei allen postnatalen Stadien wird eine Vollnarkose mit Isofluran in reinem Sauerstoff verdampft erhalten, aber das Anästhetikum Ergebnis hängt stark vom Alter ab. In ersten Versuchen an P1-P4, bevor örtlicher Betäubung in das Protokoll eingeführt wurde, war es schwierig, eine tiefe und verlängerte Sedierung aufgrund einer engen Dosis-Wirkungs-Fenster zwischen unzureichender Sedierung und Überdosierung zu erhalten. Zusätzlich zu einer neurotoxischen Wirkung von Isofluran bei neugeborenen Tieren wurden 27-30 erhoben Bedenken im Zusammenhang. Eine Kombination von Isofluran und das Lokalanästhetikum Bupivacain führt zu einem tieferen und stabiler Anästhesie, während eine Isofluran Dosisreduktion um den Faktor 2-3 zu ermöglichen. Verschiedene Arten von anesthesia wurden neonatal Nagetieren, einschließlich cryoanesthesia 31,32, aber eine mögliche Unbequemlichkeit cryoanesthesia ist seine neuroprotektive Wirkung (rezensiert von 33,34), beschrieben , die die Erzeugung eines effizienten und reproduzierbaren Verletzungen komplizieren könnte. Barbiturat-basierte Anästhesie wird als eine geringere Effizienz bei neugeborenen Mäusen haben aufgrund der geringeren Mengen an Serumalbumin und Körperfett als bei Erwachsenen 35,36.

Obwohl ziemlich invasive und traumatische, sobald das Verfahren während der Operation festgestellt wird, um die Mortalitätsrate ist niedrig. Es gibt jedoch wichtige Schritte während des Verfahrens, die besondere Aufmerksamkeit erfordern die Wiederherstellung und das Überleben der Mäuse betrieben zu verbessern. Eine wichtige Frage ist, Welpen zu wählen, die die beste Chance haben, um die Operation zu überleben. Wenn der Wurf der Ernährungszustand der einzelnen Welpen groß ist unterschiedlich. Zusätzlich zu der unvermeidbaren Blutungen, die während der Operation auftritt, ausgeben betrieben Welpen Stundes von der Mutter weg, und sie oft nicht trinken Milch vor dem nächsten Morgen. Es ist somit ein Vorteil Welpen zu wählen, die bereits eine bestimmte Menge an Milch im Magen haben. Das ist gut sichtbar durch die Bauchhaut von P0 bis P7.

In der ersten Nacht ist der Betrieb Welpe mit großem Risiko der von der Mutter ausgeschlachtet werden. Während der anfänglichen Entwicklung dieses Modells mehr als die Hälfte der operierten Mäusen fehlten am nächsten Morgen mit klaren Spuren von Blut in den Käfig. Necrophagy, Kannibalismus und Kindestötung bei Nagetieren sind seit Jahrzehnten 37-40 untersucht. In dieser Studie wurde Zeuge Kannibalismus nur einmal, sondern war eine wahrscheinlichere Erklärung als necrophagy angesehen, da die Welpen, die auf den Käfig waren in der Regel in so guter Form zurückgegeben wurden, dass der Tod durch natürliche Ursachen in der Nacht schien unwahrscheinlich. Dies veranlasste die Idee eines reversiblen pharmakologischen Wirkstoff wie Diazepam Angst und Aggressivität i zu reduzierenn die Mutter (Bewertung von 41). Die intraperitoneale Injektion von Diazepam erheblich verbessert die Situation, fallen die Sterblichkeit in der ersten Nacht von mehr als 60% auf weniger als 20%.

Die Reduzierung der Wurfgröße durch die Keulung und stören die Streu so wenig wie möglich nach der Operation Rückkehr sind zusätzliche Elemente, die die operierten Tiere profitieren können. Doch mit der Mutter nur betrieben Welpen verlassen, ist nicht von Vorteil. Die beste Balance der operierten / unbetätigt Welpen kann sich je nach der Linie, aber für ICR und SCID-ICR-Mäuse 4-5 betrieben Welpen (Verletzung oder Schein) zusammen mit 3-4 nicht operierten Jungen verlassen die besten Ergebnisse lieferte.

In einem allgemeinen Sinn ist die Hauptbeschränkung dieses neonatal SCI Modell, dass die neonatale unterscheidet Rückenmark in vieler Hinsicht von adulten Rückenmark, und somit nicht experimentellen Ergebnisse liefern können, die denen von Erwachsenen SCI Modellen erhaltenen vergleichbar sind. Solche Unterschiede sind Gesamtgröße undUnterrepräsentation spezifischer Zelltypen Volumen des Rückenmarks, der Zellzahl, wie beispielsweise Oligodendrozyten, unreife Immunantworten und unreife neuronaler Schaltkreise. Schlussfolgerungen aus Experimenten in diesem Modell gezogen muss daher sorgfältig abgewogen werden. Auf der anderen Seite ist das Modell für die relativ weniger untersuchten Szenario von pädiatrischen SCI relevant. Darüber hinaus ist die scheinbare Schwäche gegenüber erwachsenen SCI Modelle auch eine potentielle Festigkeit, da es die Aufklärung der Plastizitätsmechanismen erlauben kann, obwohl die minimal vorhandenen im adulten Rückenmark, ein therapeutisches Substrat, wenn wieder darstellen. Es ist denkbar, dass Wieder neonataler oder auch embryonalen Bedingungen durch die Implantation von weniger entwickelten Zellen oder Gewebe oder durch Behandlung mit Reagenzien, die die adultem Gewebe mit früheren Entwicklungseigenschaften erzeugen umgesetzt werden könnten. Verwendung von Enzymen perineuronal Netze zu beseitigen ist ein Beispiel für den letzteren Ansatz 42,43.

<p class="Jove_content"> ein großes Problem, wenn ein Tiermodell für SCI Festlegung ist eine standardisierte Verletzung zu erhalten. Dies ist ein wichtiger Aspekt, der in mehrere SCI – Modellen adressiert wurde, zum Beispiel transection, hemisection, Impaktoren, Ballon – Kompression, Zangen zerdrücken, statische Gewicht Kompression usw. Im Hinblick Geräte beeinflussen, Anstrengungen in dieser Richtung haben in SCI Modelle in Folge erwachsenen Nagetieren , wo mehrere Parameter der Auswirkungen wie Geschwindigkeit, Kraft und Dauer (von 44 überprüft) manipuliert werden. Ein weiterer Ansatz, weniger Ausrüstungen zum Einsatz, verwendet eine Modifikation des Kerr-Lougheed Aneurysma – Clip 45,46. Diese zwei Ansätze ergänzen sich wie der Impaktor eine Prellung Verletzung während die Klammer ahmt ein Kompressionsverletzung mit einem gewissen Grad an gleichzeitigen Ischämie nachahmt. Aufgrund der erheblichen Größenbeschränkungen und eine größere Anfälligkeit von neugeborenen Mäusen, die eine höhere Sterblichkeit bei längeren Operationen verbunden sind, sowie die Kosten für die Entwickwicklungs Ausrüstung kleineren Maßstab wurde gewählt, um einen Clip-generierte Kompression statt Impactor generierten Quetschung Ansatz zu entwickeln. Dies wurde durch einen handelsüblichen Aneurysma Miniclip Anpassung der Größe der Wirbelsäule von neugeborenen Mäusen 1 aufzunehmen. einen Stopper Zugabe gewährleistet eine einheitliche Verdichtungsbreite, und solange die Spannung der Klammer an der Grenze des Stopfens komprimiert, sollte die Kraft der Kompression während der statischen Phase zu minimalen Breite wenig variieren. Was ist nicht genormt ist die Geschwindigkeit der Kompression während der dynamischen Phase, da dies als Clip Spannungsänderungen über seine Lebensdauer variieren. Da die statische Phase der Kompression wesentlich länger als die dynamische Phase dauert, und es gibt wenig dafür, dass das Rückenmarksgewebe viel von einer Gegenkraft gegen die Mini-Clip Klingen ausübt, ist es wahrscheinlich, dass die Schwere der Verletzung ist die meisten abhängig von die statische Phase. Dies bleibt jedoch geprüft werden. VerletzungSchwere wahrscheinlich auf mehreren Faktoren abhängen, einschließlich der statischen Druckkraft und die Dauer, die Geschwindigkeit der Kompression und Dekompression, die Position der Mini-Clip, und der Anzahl von Kompressionen an der gleichen Stelle durchgeführt. Somit kombinatorische Variation dieser Parameter bei der Erzeugung eines Spektrums Verletzungs severities von schwach bis schwerer führen könnte. Trotz des Potenzials für Variabilität in unserer bisher veröffentlichten Studie 1 erhalten wir konsistente Ergebnisse bei histologischen, physiologische und Verhaltensebene, so dass es wenig zu deuten darauf hin , dass eine akzeptable Standardisierung schwer zu erreichen ist . Wir stellen fest , dass in dieser Studie haben wir mehrere Methoden zur Prüfung auf jeder Ebene, einschließlich Verhaltenstests wie Luft-Stepping , wie in Abbildung 5 dargestellt.

In diesem Neugeborenen SCI Modell erspart der Verletzung einen gewissen Anteil von Axonen und bietet dadurch eine Situation günstig für die Hervorrufung adaptive Plastizität durch die Wieder modeling verschont Verbindungen und die Bildung neuer Schaltungen. Darüber hinaus gut, da die Neugeborenen-Maus für die Untersuchung von vielen experimentellen Methoden geeignet ist, ist es möglich, dieses Modell zu verwenden, die funktionelle Erholung und adaptive Plastizität mit einem integrativen Ansatz zu untersuchen, einschließlich Verhaltenstests, retrograden und anterograden axonalen Tracing, Immunhistochemie, Elektrophysiologie und hohe -throughput optischen Aufzeichnungs 1. Als Beispiel haben wir die Vorteile dieser integrative Ansatz zur Netzwerk Re-Modellierung auf der Ebene der spezifischen absteigenden Eingänge mit hohem Durchsatz Kalzium – Imaging in ex vivo Wholemount Vorbereitungen des Hirnstamms und verletzte Rückenmark 1 zeigen. Dies kann weiter vorangetrieben werden durch neurooptogenetische und optogenetische Pharmakologie Tools mit dem Umbau der synaptischen Verbindungen zwischen bestimmten Subpopulationen von spinalen Neuronen zu beurteilen.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work has been supported by grants from the South-Eastern Norway Regional Health Authority (JLB, 2014119; JCG, project numbers 2015045 and 2012065), by the Norwegian Research Council (JCG, project number 23 00 00) and the University of Oslo.

Materials

Plastic seringe (30 or 50 mL)
Plastic petri dish (150x25mm)
Fortec isoflurane vaporizer Cyprane We use and old device out of production, check the link for newer device
Yasargil temporary aneurysm mini-clip Æsculap FE681K
Fine -Bore Polyethylene tubing ID 0.58mm, OD 0.96mm Smiths Medical 800/100/200
Isoflurane (Forene) Abbott GmbH & Co. KG
Marcain (Bupivacain) AstraZeneca
Insuline seringe 0.3ml 30Gx8mm VWR 80086-442
Ultra Fine Micro Knife 5mm cutting edge Fine Science Tools 10315-12
Extra Fine Graefe Forceps – 0.5mm Tip Fine Science Tools 1153-10 Not really necessary, often the teeth are too large
Forceps SuperGrip Straight Fine Science Tools 00632-11 Two forceps are necessary
Spongostan Special 70 x 50 x 1 mm Ferrosan
Vannas Spring Scissors – 2mm Blades Straight Fine Science Tools 15000-03
Vario Clip Applying Forceps Aesculap FE502T
Vicryl 6–0 (Ethicon) Johnson and Johnson J105G
Diethrich micro needle holder 11-510-20
Temgesic (buprenorphine) Schering-Plough
Stesolid (diazepam) Actavis Also known as Valium
Pedamix Fresenius Kabi
Klorhexidinsprit (chlorhexidine gluconate) Fresenius Kabi D08A C02
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Züchner, M., Glover, J. C., Boulland, J. A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model. J. Vis. Exp. (109), e53498, doi:10.3791/53498 (2016).
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