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Biologia

El aislamiento de regiones genómicas específicas e identificación de moléculas asociadas por enChIP

Published: January 20, 2016
doi:
10.3791/53478
,
1Chromatin Biochemistry Research Group, Combined Program on Microbiology and Immunology, Research Institute for Microbial Diseases,Osaka University

Summary

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

Abstract

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

Introduction

Se requiere la identificación de moléculas asociadas con las regiones genómicas específicas de interés para entender los mecanismos de regulación de las funciones genómicas tales como la transcripción y la regulación epigenética. Aunque varios se han desarrollado técnicas para el análisis bioquímico de las regiones genómicas específicas 1-7, no se utilizan ampliamente en esta etapa debido a sus problemas intrínsecos tales como la aplicación limitada (por ejemplo, sólo para alto número de copia o loci loci con repeticiones) y demasiado tiempo y esfuerzos requeridos.

Con el fin de realizar el análisis bioquímico de regiones genómicas específicas fácilmente, hemos desarrollado dos tecnologías locus específicos cromatina immunoprecipitation (CHIP), a saber, por inserción de chip (ichip) 8.13 y diseñados chip molécula mediada por unión al ADN (enChIP) 14-17 . En ichip, un lugar de interés se marca mediante la inserción de secuencias de reconocimiento de una proteína de unión al ADN exógeno como LexA. El lugar se aísla mediante purificación por afinidad utilizando la proteína de unión al ADN etiquetados. Complejos En enChIP, ingeniería moléculas de unión al ADN, tales como proteínas de dedos de zinc, la transcripción (TAL) proteínas del tipo activador, y agrupados interspaced regularmente repeticiones palindrómicas cortas (CRISPR), se utilizan para etiquetar un locus de interés (Figura 1). Posteriormente, la región genómica se aísla mediante purificación por afinidad de las moléculas de unión al ADN etiquetados.

Una de las ventajas de enChIP sobre ICHIP es que la inserción de secuencias de reconocimiento de una proteína de unión a ADN exógeno no es necesario. Focalización de loci usando complejos CRISPR que consisten en una forma catalíticamente inactiva de Cas9 (dCas9) y una guía de ARN (gRNA) es mucho más fácil que la orientación de estas regiones por ichip o enChIP utilizando proteínas TAL y zinc-finger. Aquí se describe un protocolo de paso a paso para enChIP combinada con espectrometría de masas y secuenciación de ARN (RNA-Seq) para identificar locus-asoproteínas y ARNs TED, respectivamente.

Protocol

1. Diseño de moléculas de ADN vinculante Engineered Reconociendo el locus diana Para enChIP utilizando complejos CRISPR, utilice la herramienta web CRISPRdirect (http://crispr.dbcls.jp) para identificar secuencias candidato objetivo gRNA en la región genómica de interés descrito previamente 18. Esta herramienta web devuelve 23 pb sitios genómicos de la forma 5'-N 20 NGG-3 'dentro de la región de destino. Sintetizar una gBlock incluyendo la secuencia del promotor U6 y la secuencia de 5'-N 20 en 5'-N 20 NGG-3 'usando los servicios comerciales (ver Figura 2) 19,20. Para propósitos de la subclonación, incluir sitios de enzimas de restricción apropiadas fuera de la gBlock. Inserte la gBlock en un vector apropiado tal como se describe anteriormente 16. Varios vectores retrovirales para Gblocks están disponibles (ver Materiales). Para enChIP utilizando proteínas TAL, diseñar proteínas TAL reconociendo la target loci. Generar plásmidos que codifican proteínas TAL utilizando servicios comerciales. Generar vectores de expresión que contienen las proteínas TAL fusionados con una o más etiquetas tales como FLAG 3 × 15 como se describió anteriormente. 2. Establecimiento de células para el Análisis enChIP Expresar 3 × FLAG-dCas9 y la gRNA (procedimiento basado en CRISPR) o 3 × FLAG-TAL (procedimiento a base de proteínas TAL) en las células a analizar como se describe anteriormente 14-17 de. Utilice transfección transitoria si la eficiencia de transfección es alta. Un vector de expresión que contiene 3 × FLAG-dCas9 y el promotor CMV está disponible (ver Materiales). Considerar el establecimiento de transformantes estables usando métodos convencionales si la eficiencia de transfección transitoria es baja. Además de los vectores retrovirales mencionados anteriormente para gBlock, vectores retrovirales de 3 × FLAG-dCas9 están disponibles (ver Materiales). <li> Confirmar la expresión de la 3xFLAG-dCas9 o proteína 3xFLAG-TAL en las células transfectadas por análisis de inmunotransferencia usando un anticuerpo anti-FLAG (Ab) como se describió previamente 14-17 de. Nota: La expresión de estas proteínas etiquetadas también puede ser confirmada por tinción intracelular con anti-FLAG-FITC y un análisis FACS subsiguiente. Un protocolo para la tinción intracelular se puede descargar desde nuestra página web (http://www.biken.osaka-u.ac.jp/lab/microimm/fujii/iChIP_protocols/english.html). Confirmar la expresión de la gRNA por la técnica de RT-PCR estándar. Para la identificación cuantitativa de las proteínas que interactúan con la región genómica de interés, considere el uso de un etiquetado de isótopos estables de aminoácidos en cultivo celular (SILAC) análisis combinado con enChIP (enChIP-SILAC). Nota: los medios de comunicación para el análisis SILAC se pueden adquirir de proveedores comerciales. SILAC es de gran alcance en la detección de interacciones específicas. Células de cultivo en un medio pesado SILAC. Preparar células culturoja en medio de luz SILAC como control negativo. Utilice al menos 5 × 10 7 células para cada medio SILAC (pesada o ligera). Para el etiquetado eficiente, añadir tanto L-lisina-2HCl, 13 C 6 y L-arginina-HCl, 13 C 6, 15 N 4 en los medios SILAC pesados. Nota: Por lo menos cinco divisiones celulares son necesarias para las proteínas de la etiqueta. Por ejemplo, cultivo de células de fibrosarcoma humano HT1080 que expresan establemente 3xFLAG-dCas9 y un gRNA a 37 ° C y 5% de CO 2 en medios DMEM durante SILAC y suero bovino fetal dializado con lisina-2HCl plus L-Arginina-HCl (medio de Luz) o 13 C 6 L-lisina-2HCl más 13 C 6 15 N 4 L-arginina-HCl (medio pesado) (ver Materiales) 16. Añadir 50 mg de ligero o pesado L-lisina-2HCl y L-arginina-HCl en 500 ml de medio. Células trypsinize y replate antes de que sean confluentes para que las células mantienen growt exponencialmarido. 3. La reticulación de las células con formaldehído Para las células en cultivo en suspensión, transferencia de 2 × 10 7 células que expresan proteínas 3xFLAG-tal o 3xFLAG-dCas9 más gRNA y suspender en 30 ml de medio de cultivo regular en un tubo de centrífuga de 50 ml. Cuando se usan más células, aumentar los volúmenes y cantidades de reactivos proporcionalmente. Para los experimentos de SILAC, mezclar las células cultivadas en un medio pesado o mediano ligero (5 x 10 7 células cada uno) y dividir el total de 1 x 10 8 células en 5 tubos que contienen 2 x 10 7 células. Añadir 810 l de 37% de formaldehído a 30 ml de la suspensión celular (concentración final 1%) y se incuba a 37 ° C durante 5 min. Para las células adherentes, fijar directamente las células en placas de cultivo mediante la adición de 810 l de 37% de formaldehído a 30 ml de medio de cultivo. Detener la reticulación mediante la adición de 3,1 ml de 1,25 M solución de glicina (concentración final 127 mM), yincubar a TA durante 10 min. Recoger las células por centrifugación (300 xg durante 5 min a 4 ° C). Deseche cuidadosamente el sobrenadante incluyendo formaldehído y almacenarlo en una botella de recuperación apropiado. Para las células adherentes, separar las células con un raspador celular y la cosecha en un tubo de 50 ml, y recoger las células como se describe en este paso. Para los experimentos de SILAC, mezclar las células desprendidas cultivadas en un medio pesado o mediano ligero (5 x 10 7 células cada uno), se divide el total de 1 x 10 8 células en 5 tubos que contienen 2 x 10 7 células, y recoger las células como se describe en este paso. Lavar el sedimento celular con 30 ml de PBS dos veces por tubo. Deseche cuidadosamente el sobrenadante incluyendo formaldehído y almacenarlo en una recuperación apropiado bottle.Handle los residuos de formaldehído de acuerdo con las directrices de seguridad química. Las células fijadas pueden ser congelados y almacenados a -80 ° C. 4. Preparación de la cromatina (por 2 x 107 células) Suspender las células fijadas en 10 ml de tampón de lisis celular (Tris 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM, 0,5% de Igepal CA-630, y 1 × inhibidores de la proteasa) y se incuba en hielo durante 10 min. Centrifugar la muestra (830 × g a 4 ° C durante 8 min) y descartar el sobrenadante con cuidado. Suspender el sedimento en 10 ml de tampón de lisis nuclear (Tris 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM, NaCl 0,5 M, 1% de Triton X-100, desoxicolato de sodio 0,5%, 0,5% lauroilsarcosina, y inhibidores de la proteasa 1X). Incubar en hielo durante 10 min y Vortex cada 2-3 min. Centrifugar la muestra (830 × g a 4 ° C durante 8 min) y descartar el sobrenadante con cuidado. Lavar el precipitado en 10 ml de PBS. El sedimento (fracción de cromatina) se puede almacenar a -80 ° C después de la congelación inmediata en nitrógeno líquido. 5. La sonicación de la cromatina (por 2 x 10 7 células) Suspender la fracción de la cromatina en 800 l detampón de lisis modificado 3 (10 mM Tris (pH 8,0), EDTA 1 mM, NaCl 150 mM, 0,1% de desoxicolato de sodio, 0,1% de SDS, y 1x inhibidores de la proteasa) y transferir a un tubo de 1,5 ml. Sonicar la cromatina utilizando un sonicador (ver Materiales) y las siguientes condiciones: salida: 3; deber: 100% (continuo); y hora: gratuito. Realizar 10-18 ciclos de sonicación durante 10 segundos y enfriamiento en hielo durante 20 seg. Para evitar un calentamiento excesivo, incubar las muestras en hielo durante 2 minutos cada 5-6 ciclos. Para evitar la formación de espuma, mantener la posición de la punta de la sonda de sonicación 0,5 cm por encima del fondo del tubo. Centrifugar la muestra a (16.000 × g a 4 ° C durante 10 min) y transferir el sobrenadante a un tubo de 1,5 ml. La cromatina sonicado se puede almacenar a -80 ° C después de la congelación inmediata en nitrógeno líquido. 6. Evaluación de la cromatina Fragmentación Mezclar 10 l de la cromatina fragmentada con 85 l de agua destilada. Añadir 4 lde NaCl 5 M y se incuba a 65 ° CO / N. Añadir 1 l de 10 mg / ml de RNasa A y se incuba a 37 ° C durante 45 min. Añadir 2 l de EDTA 0,5 M (pH 8,0), 4 l de 1 M Tris (pH 6,8), y 1 l de 20 mg / ml de proteinasa K, y luego se incuba a 45 ° C durante 1,5 hr. Separadas 10 l de la muestra por electroforesis en un gel de agarosa al 1% que no contiene colorantes de tinción, tales como SYBR Green. Tinción del gel para evaluar la distribución de las longitudes de la cromatina fragmentado. Se recomiendan las condiciones que generan una longitud media de 0,5 a 2 kpb (rango de 0,2 a 4 kpb). Se purifica el ADN de las muestras restantes por extracción con fenol-cloroformo o mediante el uso de un kit de extracción de ADN (ver Materiales). El ADN purificado se puede utilizar como ADN de entrada para estimar los rendimientos de los análisis enChIP (véase 8.11). 7. Preparación de Dynabeads conjugado con anticuerpos (por 2 x 10 7 células) Prepare dos tubos de 1,5 ml, uno para pre-compensación utilizando IgG de ratón normal y el otro para la incubación con el anti-FLAG Ab. Añadir 150 l de perlas magnéticas-G conjugado de proteína (ver Materiales) a cada tubo. Colocar los tubos en un soporte de imán y esperar 3 min. Descartar el sobrenadante con la pipeta. Suspender las perlas en 1 ml de PBS que contenía 0,01% de Tween-20 (PBS-T). Colocar los tubos en un soporte magnético y esperar a 2 min. Descartar el sobrenadante con la pipeta, y luego repita el paso. Suspender las perlas en 1 ml de PBS-T que contiene 0,1% de BSA. Añadir 15 g de IgG de ratón normal o anti-FLAG Ab y gire a 4 ° CO / N. Centrifugar brevemente, a continuación, coloque los tubos en un soporte de imán y esperar 3 min. Descartar el sobrenadante con la pipeta. Suspender las perlas en 1 ml de PBS-T. Invierta la muestra varias veces y centrifugar brevemente. Colocar los tubos en un soporte de imán y esperar a 3 min, a continuación, descartar el sobrenadante mediante pipeteo. Repita el lavadodos veces más con PBS-T (un total de tres pasos de lavado). 8. La cromatina Immunoprecipitation (por 2 x 10 7 células) Mezclar la cromatina fragmentado preparado en 5.3) (aproximadamente 800 l) con una quinta parte del volumen (aproximadamente 200 l) de tampón de lisis modificado 3 que contiene 5% de Triton X-100 (concentración final de 1% de Triton X-100). Añadir la solución de la cromatina al tubo en el que se prepararon perlas magnéticas Proteína G-conjugados conjugadas con IgG de ratón normal. Rotar a 4 ° C durante 1 hr. Se coloca el tubo en un soporte de imán y esperar 3 min. Transferir el sobrenadante en el tubo en el que se prepararon perlas magnéticas Proteína G-conjugados conjugados con Ab anti-FLAG. Gire a 4 ° CO / N. Se coloca el tubo en un soporte de imán y esperar 3 min. Descartar el sobrenadante con la pipeta. Suspender las perlas en 1 ml de tampón de baja salinidad (Tris 20 mM (pH 8,0), EDTA 2 mM, NaCl 150 mM, 1% Triton X-100, inhibidores de la proteasa SDS, y 1x 0,1%) y giran a 4 ° C durante 5 min. Se coloca el tubo en un soporte de imán y esperar 3 min. Descartar el sobrenadante con la pipeta y repita el paso de lavado. Lavar las perlas con tampón de alto contenido de sal (Tris 20 mM (pH 8,0), EDTA 2 mM, NaCl 500 mM, 1% Triton X-100, inhibidores de la proteasa SDS, y 1x 0,1%) dos veces. Lavar las perlas con tampón de LiCl (10 mM Tris (pH 8,0), EDTA 1 mM, 250 mM LiCl, 0,5% de Igepal CA-630, 0,5% de desoxicolato de sodio, e inhibidores de proteasa 1X) dos veces. Lavar las perlas con TBS-IGEPAL CA-630 (Tris 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, inhibidores de IGEPAL CA-630, y 1x de proteasa 0,1%) una vez. Suspender las perlas en 200 l de tampón de elución (Tris 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, 0,1% de Igepal CA-630, inhibidores de la proteasa 1x, y 500 mg / ml 3 péptido × FLAG) y se incuba a 37 ° C durante 20 minutos. Se coloca el tubo en un soporte de imán y esperar 3 min. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml y repetir el elutel paso de iones. Se purifica el ADN de pequeña porción (por ejemplo, 5%) del eluato por extracción con fenol-cloroformo o mediante el uso de un kit de extracción de ADN (ver Materiales). El ADN purificado puede ser utilizado para la PCR con el cebador específico se establecen para estimar los rendimientos de enChIP analiza mediante la comparación con el ADN de entrada preparada en la Etapa 6.7 como se describe anteriormente 14,16. 9. SDS-PAGE, tinción y análisis de espectrometría de masas Mezclar el eluato (400 l) con 1 ml de 2-propanol, 50 l de acetato de sodio 3M (pH 5,2), y 5 l de 20 mg / ml de glucógeno. Precipitar la cromatina a -20 ° CO / N. Centrifugar la muestra (16.000 × g a 4 ° C durante 30 min) y descartar el sobrenadante. Enjuague el sedimento con 1 ml de etanol al 70% y se centrifuga de nuevo (16.000 × g a 4 ° C durante 10 min). Eliminar el sobrenadante por completo con la pipeta. Suspender el sedimento en 40 l de tampón de muestra 2x (Tris 125 mM (pH 6,8), 10% 2-mercaptoethanol, 4% SDS, 10% de sacarosa, y 0,004% de azul de bromofenol). Vortex durante 5 min para disolver la pastilla completamente y, a continuación se incuba a 100 ° C durante 30 min para desnaturalizar las proteínas y revertir la reticulación. Para SDS-PAGE, correr 40 l de la muestra en el gel hasta que el colorante alcanza 1 cm por debajo del pozo. Nota: Utilizamos generalmente 4-20% geles de gradiente, pero otros% geles pueden ser utilizados. Tinción del gel con azul brillante de Coomassie o tinción de plata. Cortar el gel en cinco piezas (2 mm de altura). Realizar la digestión en gel y el análisis de espectrometría de masas como se describió previamente 13-16 de. Para los experimentos de SILAC con 5 x 10 7 células cada uno (total de 1 x 10 8 células), suspender pellet a partir de los cinco tubos iniciales en 40 l de tampón de muestra 2x (no es necesario para escalar hacia arriba). 10. Purificación de análisis de ARN y ARN-Seq Para purificar el ARN después de enChIP, añadir 5 U / ml de inhibidor de RNasa (seMateriales e) a todas las soluciones tampón, excepto tampón de lisis modificado 3 y el tampón de elución, a los que suman 40 U / ml de inhibidor de RNasa. Mezclar el eluato (400 l) con 16 l de NaCl 5 M y se incuba a 65 ° C durante 2 hr. Añadir 1 ml de reactivo a base de ácido guanidinio-fenol-(ver Materiales) a la muestra. Vortex durante 15 segundos y luego se incuba a RT durante 5-15 min. Centrifugar la muestra durante 15 min a 12.000 × g y RT. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml y añadir 5 l de p-bromoanisol. Vortex durante 15 segundos y luego se incuba a temperatura ambiente durante 3-5 min. Centrifugar la muestra durante 10 min a 12.000 × g y RT. Transferir el sobrenadante (aproximadamente 1 ml) en un nuevo tubo 2 ml y se añade 1 ml de 2-propanol. Invertir el tubo e incubar a TA durante 10 min. Cargar la mezcla en una columna en un kit de purificación de ARN (ver Materiales). Centrifugar la columna durante 1 minuto a 12.000 × g y RT. lavarla columna con 400 l de ARN tampón de lavado en un kit de purificación de ARN (ver Materiales). Añadir 80 l de DNasa I cóctel (mezcla de 5 l de DNasa I (1 U / l), 8 l de 10 × DNasa I tampón de reacción, 3 l de DNasa / RNasa libre de agua, y 64 l de ARN tampón de lavado en un kit de purificación de ARN (ver Materiales)) a la columna. Incubar la muestra a 37 ° C durante 15 min y centrifugar durante 30 segundos a 12.000 × g y RT. Lavar la columna con 400 l de ARN prelavado Buffer en un kit de purificación de ARN (ver Materiales) dos veces. Eluir el ARN con 50 l de DNasa / RNasa libre de agua. El ARN eluido se puede utilizar para la secuenciación de ARN.

Representative Results

En general, 1-30% de las regiones genómicas diana se puede purificar usando enChIP. Figura 3 incluye datos representativos que muestran los rendimientos de los análisis enChIP focalización telómeros y el promotor del interferón (IFN) de regulación del factor 1 (IRF-1) de genes. Como ejemplos de los resultados típicos, La Tabla 1 enumera las proteínas asociadas con el promotor de IRF-1 de una manera IFN-específico identificado por enChIP-SILAC, la Tabla 2 se enumeran las proteínas de unión a telómeros identificados por enChIP combinada con espectrometría de masas (enChIP-MS) y la Tabla 3 se enumeran los RNAs asociados con telómeros identificados por enChIP-RNA-Seq. Figura 1. Visión general de enChIP. enChIP usando CRISPR (A, B) y TAL (C, D, E </strong> se muestra). Un lugar de interés es etiquetado con moléculas de unión al ADN de ingeniería como una proteína TAL o el sistema CRISPR que consiste en una forma catalíticamente inactiva de Cas9 (DCA) y guías de ARN (gRNA). Las interacciones moleculares se fijan con formaldehído u otros agentes de reticulación, si es necesario. Posteriormente, la cromatina se fragmenta fijo por sonicación o digestión enzimática. Las regiones genómicas etiquetados se purifican mediante purificación por afinidad. Por último, la reticulación se invierte, y las moléculas que interactúan (regiones genómicas, ARN y proteínas) se identifican mediante la secuenciación de próxima generación y espectrometría de masas. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2. Secuencia de gBlock. El promotor U6 (en negro), el G nucleótidos bntes de la secuencia guía (en azul), se muestra la secuencia de guía (gRNA espaciador) (en rojo), la secuencia de andamio (en verde) y la secuencia de terminación (en naranja). Figura 3. Los rendimientos de los análisis enChIP representativo. Entradas (A) Porcentaje de la meta de la FIC-1 locus y el locus Sox2 no objetivo. Entradas (B) Porcentaje de los telómeros objetivo y no objetivo gamma-satélites. Las cifras se han adaptado y modificado a partir de las publicaciones anteriores 15,16. Categorías Proteínas Transcripción DDX1, PARP1, CKAP4, Pescadillo homólogo, PURβ, activado ARN polimerasa II p15 activador transcripcional, BTF3, Myb vinculanteproteína 1A Desacetilación de histonas, componentes correpresores Rbbp4, PA2G4, TBL3 Acetiltransferasa Proteína arginina N-metiltransferasa 1 ADN topoisomerasa ADN topoisomerasa 2α Las histonas Histona H2A.Z, H3.2 histonas Tabla 1:. Ejemplos de proteínas asociadas con la región promotora IRF-1 humano de forma IFN-específico identificado por enChIP-SILAC La tabla ha sido adaptada de una publicación anterior 16. Categorías Proteínas Proteínas de unión telómeros mamíferos PML, RPA, CDK1, PARP1, PCBP1 Telómeros bi-proteínas hallazgo en la levadura u otros organismos IMP4 Las proteínas que interactúan con los telómeros vinculante proteínas [proteína de unión de los telómeros asociada] ADN polimerasa α (POLA1) [Cdc13p], ARMC6 [TRF2], CTBP1 [FoxP2-POT1], exportina-5 [terc], GNL3L [TRF1], exportina-1 [terc], 14-3-3 [terc] Las proteínas de localización de heterocromatina BEND3 Las proteínas que regula las marcas epigenéticas KDM5C Las proteínas cuyas mutaciones afectan la función de los telómeros Α ADN polimerasa (POLA1), Hat1, Nup133, CDK7, DPOE1, Prdx1, TYSY, -glutamato cisteína ligasa, glutarredoxina, SMRC1 Tabla 2:. Ejemplos de proteínas asociadas con telómeros ratón identificados por enChIP-MS La mesa ha sido ADAPTEd de una publicación anterior 15. Categorías RNAs Componentes de la telomerasa Terc, rMRP Telomérica RNAs Terras scaRNAs Scarna6, Scarna10, Scarna13, Scarna2 H / ACA snoRNAs Snora23, Snora74a, Snora73b, Snora73a C / D snoRNAs Snord17, Snord15a, Snord118 lncRNA Neat1 Tabla 3: Ejemplos de ARN asociados con telómeros ratón identificados por enChIP-RNA-Seq La tabla ha sido adaptada de una publicación anterior 17..

Discussion

Here, we describe the purification of specific genomic regions using engineered DNA-binding molecules such as the CRISPR system and TAL proteins, and the identification of proteins and RNAs bound to these genomic regions. Binding of engineered DNA-binding molecules to the genome may affect chromatin structure, including nucleosome positioning, and may abrogate genomic functions, as described in CRISPR interference experiments21. To avoid these potential aberrant effects, we propose specific guidelines for choosing target genomic regions. First, to avoid potential inhibition of the recruitment of RNA polymerases and transcription factors, as well as disruption of nucleosome positioning around the transcription start site, the target regions for analyses of promoter regions should be several hundred base pairs upstream of (5′ to) the transcription start site. By contrast, when analyzing genomic regions with distinct boundaries, such as enhancers and silencers, genomic regions that are directly juxtaposed to these regions can be targeted because it is less likely that the binding of engineered DNA-binding molecules will affect their functions. Furthermore, it is best to avoid using target regions that are conserved among different species, because important DNA-binding molecules often bind to evolutionarily conserved regions and inhibition of their binding might disrupt the functions of the target genomic regions. In this regard, it is always necessary to check that the function of the target genomic region is maintained in the established cells used for enChIP analyses. Because multiple gRNAs can be tested easily and it is tedious and expensive to generate multiple versions of TAL or zinc-finger proteins recognizing different target genomic regions, enChIP using CRISPR is more advantageous than enChIP using other proteins.

It has been shown that dCas9 binds to off-target sites although affinity to those sites might be weaker than that to the target sites22-25. There are several ways to manage contamination of molecules bound to those off-target sites. First, the use of several, at least two, different gRNAs would be recommended. Those molecules commonly observed in enChIP using distinct gRNAs would be true positives. Second, comparison of different conditions for enChIP would be effective in cancelling contamination of non-specific molecules and molecules bound to off-target sites. Examples of those comparison sets would be (i) stimulation (-) and (+), or (ii) different cell types such as T cells vs. B cells. Finally, quantitative analysis of binding of candidate molecules should be performed to confirm their specific binding to the target sites. It is preferable to prepare cells expressing only dCas9 but not gRNA as a negative control.

Using enChIP analyses, we were able to successfully identify a number of known and novel molecules interacting with specific genomic regions (Tables 1-3)14-17. However, this technique failed to detect some other known proteins interacting with these regions. For example, STAT1 reportedly associates with the IRF-1 promoter upon IFNγ stimulation8, but our enChIP-SILAC analysis did not detect STAT1 as a protein induced to interact with this genomic region16. In addition, in the enChIP-MS analysis of telomeres, we did not detect shelterin proteins consisting of TRF-1 and TRF-215, which have been shown to interact with telomeres26. There are a few potential reasons for these discrepancies. First, the stoichiometry of binding of Stat1 to the IRF-1 promoter might be very low. It is reasonable that enChIP-MS, including enChIP-SILAC, detects proteins that are more abundantly associated with target genomic regions; hence, the analysis of more cells might be necessary to detect these proteins. Increases in the sensitivities of MS instruments would also contribute to the efficient detection of proteins with low stoichiometric binding. Second, some proteins, possibly including Stat1 and shelterins, might be difficult targets for MS analyses. Third, in our analysis of telomere-binding proteins15, the 3×FLAG-TAL proteins recognizing telomeres (3×FN-Tel-TAL) might have blocked the binding of shelterins to telomeres in a competitive fashion.

In contrast to the relative difficulty of detecting transcription factors binding to specific genomic regions using enChIP, we successfully identified epigenetic regulators such as histone modification enzymes using enChIP analyses. The success of this technique may be due to the fact that epigenetic regulators bind to a broad range of genomic regions; hence, more proteins per genomic region are available for MS. Because epigenetic regulators are increasingly recognized as important targets for drugs against intractable diseases such as cancer, enChIP would be a useful tool for the identification of epigenetic drug targets.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Ciencias de Takeda (TF); la Fundación Asahi Glass; el Memorial Fundación Uehara (HF); el Kurata Memorial Hitachi Ciencia y Tecnología de Fundación (TF y HF); Grant-in-Aid para jóvenes científicos (B) (# 25830131), subvención-en-Ayudas a la Investigación Científica (C) (# 15K06895) (TF); y una subvención-en-Ayudas a la Investigación Científica en el 'Ciclo de transcripción' Áreas Innovadoras (# 25118512 & # 15H01354), subvención-en-Ayudas a la Investigación Científica (B) (# 15H04329), subvención-en-Ayudas a la Investigación exploratoria ( # 26650059) y 'Genoma de Apoyo (# 221S0002) (IC) del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón.

Materials

gBlock synthesis service Life Technologies Gene Synthesis by GeneArt
gBlock synthesis service IDT (Integrated DNA Technologies) gBlocks Gene Fragments
pSIR-neo Addgene 51128
pSIR-GFP Addgene 51134
pSIR-DsRed-Express2 Addgene 51135
pSIR-hCD2 Addgene 51143
TAL synthesis service Life Technologies GeneArt Precision TALs
3xFLAG-dCas9/pCMV-7.1 Addgene 47948
3×FLAG-dCas9/pMXs-puro Addgene 51240
3×FLAG-dCas9/pMXs-IG Addgene 51258
3×FLAG-dCas9/pMXs-I2 Addgene 51259
3×FLAG-dCas9/pMXs-neo Addgene 51260
anti-FLAG M2 Ab Sigma-Aldrich F1804
FITC-conjugated anti-FLAG M2 Sigma-Aldrich F4049
DMEM medium for SILAC Life Technologies 89985 Other medium can be purchased from Life Technologies
Dialyzed FBS for SILAC Life Technologies 89986
L-Lysine-2HCl for SILAC Life Technologies 89987 for Light medium
L-Arginine-HCl for SILAC Life Technologies 89989 for Light medium
L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC Life Technologies 89988 For Heavy medium
L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC Life Technologies 89990 For Heavy medium
Complete, mini, EDTA-free Roche Diagnostics 4693159
Ultrasonic Disruptor UD-201 Tomy Seiko
ChIP DNA Clean & Concentrator Zymo Research D5205
Dynabeads-Protein G Life Technologies DB10004
RNasin Plus RNase Inhibitor Promega N2611
Isogen II Nippon Gene 311-07361
Direct-zol RNA Miniprep kit Zymo Research R2050
LTQ Orbitrap Velos Thermo Fisher Scientific a component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis
nanoLC Advance, Michrom Bioresources a component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis
HTC-PAL autosampler CTC Analytics a component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis
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Referências

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Keywords: EnChIPGenomic Region IsolationMolecular InteractionsTranscriptionEpigenetic RegulationDNA-binding MoleculesFLAG-dCas9FLAG-TALCross-linkingFormaldehydeGlycineChromatin ExtractionLysis BufferNuclear Lysis Buffer
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Fujita, T., Fujii, H. Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP. J. Vis. Exp. (107), e53478, doi:10.3791/53478 (2016).
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