Hedef lokusun tanıma Engineered DNA-bağlama Moleküllerin 1. Tasarım CRISPR kompleksleri kullanılarak enChIP için, daha önce, 18 olarak tanımlanan ilgili genomik bölgenin aday gRNA hedef sekanslarını tespit etmek CRISPRdirect web aracı (http://crispr.dbcls.jp) kullanın. Bu web aracı formunun 23 bp genomik siteleri döndürür 5'-N 20 NGG-3 'hedef bölge içinde. U6 promotör sekansı ve 5'-N 20 sekansına ticari hizmetlerin kullanılarak 5'-N 20 NGG-3 'içeren bir gBlock sentezlenmesi 19,20 (bakınız Şekil 2). Amaçlara alt klonlama için gBlock dışındaki uygun kısıtlayıcı enzim sitelerinin içerir. Daha önce tarif edildiği gibi 16, uygun bir vektör içine gBlock yerleştirin. GBlocks için çeşitli retroviral vektörler (Malzeme) mevcuttur. TAL proteinler kullanılarak enChIP için Targ tanıyan TAL proteinleri tasarımet loci. Ticari hizmetlerini kullanarak TAL proteinleri kodlayan plazmid oluşturun. Daha önce tarif edildiği gibi 15 3 x FLAG bir veya daha fazla etiketleri ile kaynaşık TAL proteinleri ihtiva eden ifade vektörlerini oluşturmak. EnChIP Analizi Hücre 2. kurulması 3 x FLAG-dCas9 ve gRNA (CRISPR bazlı prosedür) ya da Express 3, daha önce tarif edildiği gibi 14-17 x FLAG-TAL hücrelerinde (TAL protein bazlı prosedür) analiz edilecek. Transfeksiyon verimi yüksek ise geçici transfeksiyon kullanın. 3 x FLAG-dCas9 CMV promotörü ihtiva eden bir ekspresyon vektörü (Malzeme) mevcuttur. Geçici transfeksiyon verimliliği düşükse geleneksel yöntemler kullanılarak stabil transformantların kurulması düşünün. GBlock için yukarıda belirtilen retroviral vektörler ek olarak, 3 x FLAG-dCas9 retroviral vektörler (Malzeme) mevcuttur. <li>, Daha önce tarif edildiği 14-17 gibi bir anti-FLAG antikoru (Ab) kullanılarak bağışıklık beneklenme analizi ile transfekte edilmiş hücrelerde 3xFLAG-dCas9 ya 3xFLAG-TAL proteininin ifadesini teyit edin. Not: Bu etiketli proteinlerinin ekspresyonu, aynı zamanda, anti-FLAG-FITC ve daha sonraki bir FACS analizi ile hücre içi boyama ile teyit edilebilir. Hücre içi boyama için bir protokol bizim ana (http://www.biken.osaka-u.ac.jp/lab/microimm/fujii/iChIP_protocols/english.html) indirilebilir. Standart RT-PCR tekniği ile gRNA ifadesini onaylayın. Ilgili genomik bölge ile etkileşime giren proteinlerin kantitatif belirlenmesi için, hücre kültürü (SILAC) enChIP (enChIP-SILAC) ile birleştirildi analizinde amino asitlerle stabil bir izotop işaretleme kullanımını dikkate. Not: SILAC analizi için Media ticari satıcılardan temin edilebilir. SILAC belirli etkileşimleri tespit güçlüdür. SILAC ağır ortam kültür hücreleri. Hücreler Cultu hazırlayınBir negatif kontrol olarak SILAC ışığı ortamı olarak verilmiştir. (Ağır veya hafif) her SILAC ortamı için en az 5 x 10 7 hücreleri kullanın. Etkili bir etiketleme için, her iki L-Lizin-2HCI, 13 ° C 6 ve L-Arginin-HCl, SILAC Ağır ortam içinde 13 ° C 6, 15 N 4 ekleyin. Not: en az beş hücre bölünmesi etiket protein için gereklidir. Örneğin, kararlı bir şekilde Lizin-2HCI artı L-Arginin-HCl (Işık ortamı) SILAC için DMEM ortam ve diyalize edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu, 37 ° C'de ve% 5 CO2 seviyesinde 3xFLAG-dCas9 ve gRNA ifade kültürün insan fibrosarkoma HT1080 hücreleri ya da 13C 6 L-Lizin-2HCI artı 13 Cı 6 15 N 4 L-Arginin-HCl (Ağır ortam) 16 (Malzeme). Ortamın 500 ml hafif ya da ağır bir L-Lizin-2HCI ve L-Arginin-HCl, 50 mg ekleyin. Hücreler üslü growt muhafaza böylece tripsinize ve replate hücreler konfluent hale gelmeden önceh. Formaldehit ile Hücreler 3. çapraz bağlanması Süspansiyon kültüründe hücreler, transfer 2 x 10 7 3xFLAG-TAL proteinler veya 3xFLAG-dCas9 artı gRNA eksprese eden hücreler ve 50 ml'lik bir santrifüj tüpü içinde düzenli bir kültür ortamında 30 ml asılır. Daha fazla hücre kullanıldığında, orantılı reaktif hacimleri ve miktarlarını artırmak. SILAC deneyleri için, ağır ortam veya hafif ortamında (5 x 10 7 hücreleri her) kültüre hücrelerin karışımı ve 2 x 10 7 hücre ihtiva eden 5 tüp içine 1 x 10 8 hücre bölün. Hücre süspansiyonu (nihai konsantrasyon% 1) 30 ml% 37 formaldehit 810 ul ilave edin ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Yapışık hücreler için, doğrudan kültür ortamında 30 ml% 37 formaldehit 810 ul ekleyerek kültür kapları içinde hücrelerin tespit. 1,25 M glisin çözeltisi (nihai konsantrasyon 127 mM) 3.1 ml ekleyerek çapraz bağlanmasını durdurmak ve10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. Santrifüj (4 ° C 'de 5 dakika süre ile 300 x g) hücreleri toplamak. Dikkatle süpernatant dahil formaldehit atmak ve uygun bir atık şişe içinde saklayın. Yapışık hücreler, bir 50 ml tüp içinde, bir hücre kazıyıcı ile hasat hücreleri ayırmak ve bu aşamada tarif edildiği gibi hücreleri toplamak. SILAC deneyleri için, ağır, orta veya hafif orta (5 x 10 7 hücre her) kültüre müstakil hücrelerin karışımı 2 x 10 7 hücre içeren 5 tüpler içine 1 x 10 8 hücrelerinin toplam bölmek ve bu tarif edilen hücreleri toplamak adım. Tüp başına iki kez PBS ile 30 ml hücre pelletini yıkayın. Dikkatle formaldehit içeren süpernatant atın ve kimyasal güvenlik yönergelerine göre formaldehit atık bottle.Handle uygun bir atık saklayın. Sabitlenen hücreler dondurulmuş ve -80 ° C'de muhafaza edilebilir. Kromatin 4. Hazırlama (başına 2 x 107 hücreleri) Hücre lisis tamponu, 10 ml (10 mM Tris (pH 8.0), 1 mM EDTA,% 0.5 IGEPAL CA-630 ve 1 x proteaz inhibitörleri) sabit süspanse edilir ve 10 dakika süreyle buz üzerinde kuluçkalayın. Santrifüj örneği (8 dakika boyunca 4 ° C'de 830 x g) ve dikkatli bir supernatant atın. Nükleer lizis tamponu 10 ml pelet Askıya (10 mM Tris (pH 8.0), 1 mM EDTA, 0.5 M NaCl,% 1 Triton X-100,% 0.5 sodyum deoksikolat,% 0.5 loroilsarkosin ve 1x proteaz inhibitörleri). 10 dakika süreyle buz üzerinde inkübe ve her 2-3 dakikada bir vorteks. (830 × numuneyi santrifüj 8 dakika boyunca 4 ° C'de g) ve dikkatli bir şekilde supernatant atın. 10 ml PBS pelet yıkayın. Pelet (kromatin fraksiyonu) sıvı azot içinde hızlı soğutma, -80 ° C'de saklanabilir. Kromatin 5. Sonication (2 x 10 7 hücre başına) 800 ul kromatin fraksiyonu Askıyadeğiştirilmiş lisis tamponu 3 (10 mM Tris (pH 8.0), 1 mM EDTA, 150 mM NaCI,% 0.1 sodyum deoksikolat,% 0.1 SDS ve 1x proteaz inhibitörleri) ve 1,5 ml tüp içine aktarılır. Çıktı: (Malzeme) bir sonikatör kullanılarak kromatine ve aşağıdaki koşulları ses dalgalarına maruz 3; görev:% 100 (sürekli); ve saati: ücretsiz. 10 saniye boyunca, sonikasyon 10-18 döngü gerçekleştirmek ve 20 saniye süreyle buz üzerinde soğutuldu. Aşırı ısınmayı önlemek 2 dakika her 5-6 devir için buz üzerinde örnekleri inkübe. Köpük önlemek için, 0.5 cm tüpün tabanından sonikasyon probunun ucu konumunu tutun. Santrifüj örneği (10 dakika boyunca 4 ° C'de 16.000 x g) ve 1,5 ml tüp içine süpernatant aktarın. Sonike kromatin sıvı nitrojen içinde hızlı dondurma işleminin -80 ° C'de saklanabilir. Kromatin Parçalanma 6. Değerlendirilmesi Distile su 85 ul parçalanmış kromatin 10 ul karıştırın. 4 ul ekleve 5 M NaCI, 65 ° CO / N inkübe edin. 10 mg / ml RNase A 1 ul ilave edin ve 45 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. 0.5 M EDTA (pH 8.0), 1 M Tris (pH 6.8) 4 ul, 20 mg 1 ul / ml proteinaz K 2 ul ekleyin ve daha sonra 1,5 saat süre ile 45 ° C'de inkübe edin. Örneğin SYBR Green I boyama boyalar içermeyen bir% 1 agaroz jeli içinde elektroforez ile numunenin ayrı ayrı 10 ul. Parçalanmış kromatin uzunlukları dağılımını değerlendirmek için jel leke. 0.5-2 kbp (0,2-4 kbp'lik aralığı) ortalama uzunluğu üreten şartlar tavsiye edilir. Fenol-kloroform ekstraksiyonu ile veya bir DNA çıkarma kiti (Malzeme) kullanarak, kalan örneklerinin DNA saflaştınlır. Saflaştırılmış DNA enChIP analiz verimlerini (8.11) tahmin etmek için, giriş DNA olarak kullanılabilir. Antikorlar ile Dynabeads Konjuge 7. Hazırlama (2 x 10 7 hücre başına) Önİki 1,5 ml tüpler, normal fare IgG kullanılarak ön-temizleme için ve bir anti-FLAG Ab ile inkübasyon diğer pare. Her bir tüp, Protein G-konjuge manyetik boncuk 150 ul (Malzemeler bakınız) ekleyin. Bir mıknatıs standına tüpler koyun ve 3 dakika bekleyin. Pipetleme süpernatant atın. PBS% 0.01 Tween-20 (PBS-T) içeren 1 ml boncuk süspanse edin. Manyetik bir stand üzerinde tüpler koyun ve 2 dakika bekleyin. Pipetleme süpernatant atın ve sonra adımı tekrarlayın. % 0.1 BSA içeren PBS-T 1 ml boncuk süspanse edin. Normal fare IgG veya anti-FLAG Ab 15 ug ekleyin ve 4 ° CO / N dönmektedir. Daha sonra, kısa bir süre aşağı Spin bir mıknatıs standına tüpler koyun ve 3 dakika bekleyin. Pipetleme süpernatant atın. PBS-T 1 ml boncuk süspanse edin. Örnek birkaç kez ters çevirin ve kısaca aşağı doğru döndürün. Daha sonra pipetleme süpernatant atın, bir mıknatıs standında tüpler koyun ve 3 dakika bekleyin. Yıkama tekrarlayınPBS-T (üç yıkama adımları toplamı) ile iki kez daha. 8. Kromatin immünopresipitasyonu (2 x 10 7 hücre başına) Hacminin beşte biri% 5 Triton X-100 (% 1 Triton X-100 nihai konsantrasyon) ihtiva eden tadil edilmiş liziz tamponu 3 (yaklaşık 200 ul) ile 5.3 hazırlanan parçalanmış kromatin) (yaklaşık 800 ul) karıştırın. Normal fare IgG'si ile konjüge edilmiş Protein G-konjuge manyetik boncukları hazırlandı edildiği tüp kromatin solüsyonu ekleyin. 1 saat süre ile 4 ° C 'de döndürün. Bir mıknatıs stand üzerinde tüp yerleştirin ve 3 dakika bekleyin. Anti-FLAG Ab konjüge edilmiş Protein G-konjüge edilmiş manyetik boncukları hazırlandı edildiği tüp içine süpernatant aktarın. 4 ° CO / N at döndürün. Bir mıknatıs stand üzerinde tüp yerleştirin ve 3 dakika bekleyin. Pipetleme süpernatant atın. Düşük tuzlu tampon (20 mM Tris (pH 8.0), 2 mM EDTA, 150 mM NaCI, 1% Tri 1 ml boncuk Askıyatonluk X-100,% 0.1 SDS ve 1x proteaz inhibitörleri) ve 5 dakika boyunca 4 ° C'de döner. Bir mıknatıs stand üzerinde tüp yerleştirin ve 3 dakika bekleyin. Pipetleme Süpernatantı atın ve yıkama adımı tekrarlayın. Iki kez yüksek tuzlu tampon (20 mM Tris (pH 8.0), 2 mM EDTA, 500 mM NaCI,% 1 Triton X-100,% 0.1 SDS ve 1x proteaz inhibitörleri) ile boncuk yıkayın. Iki kez LiCI tampon maddesi (10 mM Tris (pH 8.0), 1 mM EDTA, 250 mM LiCI,% 0.5 IGEPAL CA-630,% 0.5 sodyum deoksikolat ve 1 x proteaz inhibitörleri) ile boncuk yıkayın. Bir kez TBS-IGEPAL CA-630 (50 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCI,% 0.1 IGEPAL CA-630 ve 1 x proteaz inhibitörleri) ile boncuk yıkayın. Elüsyon tamponu 200 ul boncuk Askıya (50 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl,% 0.1 IGEPAL CA-630, 1 x proteaz inhibitörleri ve 500 ug / ml 3 x FLAG peptidi), ve 37 ° C'de inkübe edin 20 dakika. Bir mıknatıs stand üzerinde tüp yerleştirin ve 3 dakika bekleyin. Yeni 1.5 ml tüp içine süpernatant aktarın ve ELUT tekrariyon adım. Fenol-kloroform ekstraksiyonu ile veya bir DNA ekstraksiyon kiti kullanılarak sıyırma sıvısının DNA küçük bir kısmı (örn, 5%) saflaştınlır (Malzeme). Saflaştırılmış DNA spesifik primer enChIP daha önce tarif edildiği gibi 14,16 Aşama 6.7'de hazırlanan giriş DNA ile karşılaştırarak analiz verimlerini tahmin etmek için ayarlar, PCR için kullanılabilir. 9. SDS-PAGE, Boyama ve Kütle Spektrometrik Analizi 1 2-propanol ml 3M sodyum asetat (pH 5.2), 50 ul ve 20 mg / ml glikojen 5 ul eluat (400 ul) karıştırın. -20 ° CO / N de kromatin çöktürün. Santrifüj örneği (30 dakika boyunca 4 ° C'de 16.000 x g) ve süpernatan atılır. (10 dakika boyunca 4 ° C'de 16.000 x g),% 70 etanol ve santrifüj yeniden 1 ml pelet durulayın. Pipetle tamamen süpernatant atın. 2x numune tamponu (125 mM Tris (pH 6.8),% 10 2-merc 40 ul pelet Askıdaaptoethanol,% 4 SDS,% 10 sakroz ve% 0.004 bromofenol mavisi). 5 dakika vorteksleyin, tamamen pelet çözülür ve daha sonra proteinleri denatüre ve çapraz bağlantıyı ters döndürecek 30 dakika boyunca 100 ° C 'de inkübe etmek. Boya çok altında 1 cm ulaşana kadar SDS-PAGE için jel üzerinde numunenin 40 ul çalıştırın. Not: Genellikle% 4-20 gradyan jelleri, ancak diğer% jeller kullanılabilmektedir. Coomassie Brilliant Blue veya gümüş boyası ile jel Leke. Beş adet (2 mm yükseklik) içine jel kesti. Daha önce tarif edildiği gibi jel 13-16 sindirim ve kütle spektrometresi ile analiz gerçekleştirir. 5 x 10 7 hücreleri, her (1 x 10 8 hücrelerin toplam) ile SILAC deneyleri için, 2x numune tampon maddesi 40 ul, ilk beş borunun (o kadar büyütmek için gerekli değildir) pelet askıya. RNA ve RNA-Seq Analizi 10. saflaştırılması EnChIP sonra RNA'yı saflaştırmak için RNaz inhibitörü 5 U / ml ilave (seTampon çözelti tüm e malzemeler), değiştirilmiş lisis tamponu 3 ve elüsyon tamponu dışında olan RNaz İnhibitörü 40 U / ml ekleyin. 5 M NaCI, 16 ul eluat (400 ul) karıştırın ve 2 saat süre ile 65 ° C'de inkübe edin. Örnek asit guanidinyum-fenol bazlı bir tepkime maddesi 1 ml (Malzemeler bakınız) ekleyin. Daha sonra 15 saniye vorteksleyin ve 5-15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. 12.000 x g ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Yeni 1,5 ml tüp süpernatantı aktarın ve p-bromoanisol 5 ul ilave edin. Daha sonra 15 saniye vorteksleyin ve 3-5 dakika için oda sıcaklığında inkübe edilir. 12.000 x g ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Yeni 2 ml'lik bir tüp içine süpernatant (yaklaşık 1 mi) aktarın ve 2-propanol 1 ml. Tüp ters çevirin ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. (Malzeme) bir RNA saflaştırma kiti bir kolona karışımı yerleştirin. 12.000 × 1 dakika boyunca santrifüj sütun g RT. Yıkamabir RNA saflaştırma kiti RNA Yıkama Tamponu 400 ul (Malzeme) ile kolon. DNase I (1 U / ul), 10 x DNase I Reaksiyon Tamponu ve 8 ul, DNase / RNase içermeyen su 3 ul, ve RNA Yıkama Tamponu 64 ul içinde 5 ul DNaz I kokteyl 80 ul ekle (karışım sütun bir RNA arıtma kiti (Malzeme)). 15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin ve daha sonra numune 12.000 x g ve oda sıcaklığında 30 saniye boyunca santrifüj. Iki kez bir RNA saflaştırma kiti RNA Ön Yıkama Tamponu 400 ul (Malzeme) ile sütun yıkayın. DNase / RNase içermeyen su, 50 ul RNA Zehir. Elüt RNA, RNA sıralaması için kullanılabilir.