بروتوكولات لتحليل دور خلايا بانيت في التجديد في الأمعاء الفئران باستخدام شرطي<em> جنة المساواة العرقية، السلمون المدخن</em> ماوس نماذج
Summary
وتتداخل الخلايا الجذعية الظهارية في الأمعاء (ISCS) مع خلايا بانيت. وتختلف هذه الخلايا ذرية من تكاليف الدعم غير المباشر، التي تدعم ISCS وتوفير الحماية المضادة للبكتيريا. نحن هنا لشرح كيف كنا المعدلة وراثيا نماذج الماوس الشرطية لإثبات أن خلايا بانيت تلعب دورا حاسما في الحفاظ على ظهائر المعوية.
Abstract
سطح الظهارية في الأمعاء الثدييات هو الأنسجة الحيوية التي تجدد كل 3-7 أيام. فهم هذه العملية تجديد حددت عدد سكانها الدراجات بسرعة الخلايا الجذعية المعوية (ISCS) التي تتميز التعبير عنها من الجين Lgr5. ويدعم هذه من قبل السكان الخلايا الجذعية هادئة، تميزت بمي-1 التعبير، قادر على استبدالها في حالة الإصابة. التحقيق في التفاعلات بين هؤلاء السكان أمر بالغ الأهمية لفهم دورهم في المرض والسرطان. موجودة في ISCS داخل الأقبية على سطح الأمعاء، هذه المنافذ تدعم ISC في تجديد وظهائر. من المرجح ينطوي على التفاعل بين ISCS النشطة والساكنة خلايا متمايزة أخرى داخل المتخصصة، كما سبق أن ثبت أن '' stemness '' من Lgr5 ISC يرتبط ارتباطا وثيقا وجود خلايا بانيت المجاورة لها. باستخدام المشروط لجنة المساواة العرقية، السلمون المدخن الماوسنماذج اختبرنا تأثير حذف غالبية ISCS النشطة في وجود أو عدم وجود خلايا بانيت. نحن هنا تصف التقنيات والتحليل الذي أجري لتوصيف الأمعاء وتبين أن الخلايا بانيت تلعب دورا حاسما في محراب ISC في مساعدة الانتعاش في أعقاب إهانة كبيرة.
Introduction
سطح اللمعية من الأمعاء الثدييات ملامح وحدات من الخبايا والإصبع تكرار مثل التوقعات، ووصف الزغب، التي تبرز في التجويف. هذا السطح هو ورقة مستمرة من ظهائر الذي يخضع الكامل التجديد الذاتي تقريبا كل 3-4 أيام 1. ويدعم هذه الأنسجة الحيوية التي يبلغ عدد سكانها الدراجات بسرعة الخلايا الجذعية (ISCS، ويعرف أيضا باسم قاعدة سرداب خلايا عمودية)، التي تم تحديدها في البداية من قبل التعبير عنها من الجين Lgr5 2،3. وتوجد هذه الخلايا في محراب المتخصصة في الجزء السفلي من الخبايا ليبركون. في البداية، كان اكتشاف أن ISCS والدراجات بسرعة المتنافرة مع الفكرة السائدة أن الخلايا الجذعية كانت هادئة في الطبيعة. السابق إلى التعرف على Lgr5 + ISC كان يفترض أن يبلغ عدد سكانها التسمية هادئة الاحتفاظ الخلايا في موقف +4، نسبة إلى قاعدة سرداب، كانت ISCS 1. البحوث التي أجريت مؤخرا حكما التوفيق الآن هذه الملاحظات من خلال إظهار أن في المقام الأول هناك مجموعة من الدراجات متساوية الفاعلية ISCS في كل سرداب التي يتم تنظيمها من قبل جيرانها 4،5 مصير. في حال ضائعون هذه يمكن أن تحل محلها خلايا هادئة التي عادة ملتزمون النسب إفرازية ولكن يمكن الرجوع إلى ISCS في حالة تلف السكان ISC 6.
الجيران ISC يمكن أن تكون إما ISCS أو خلايا ابنتهما. وISCS تنتج الخلايا الوليدة الساذجة التي تتكاثر وتتمايز إلى أنواع الخلايا المتخصصة التي تتكون من الميزانية الظهارية التي خطوط تجويف الأمعاء 1. والقدح، enteroendocrine، المعوية، خصل والخلايا M تهاجر صعودا إلى سطح اللمعية حيث أنها توفر وظائف مختلفة الاستيعابية والتنظيمية، ومع ذلك، لا تزال هناك خلايا بانيت في الجزء السفلي من سرداب حيث وجدت تتداخل مع ISCS. في السنوات الأخيرة وقد ثبت أن نسبة من daught السذاجة خلايا إيه الموجهة للنسب إفرازية هي التسمية هادئة الاحتفاظ الخلايا Lgr5 لو قادرة على العودة إلى لتكاليف الدعم غير المباشر على إصابة 6،7.
نظرا لأهميته في تجديد سرداب وضعت أولوية على فهم التفاعلات بين ISCS وجيرانها، وخاصة الخلايا بانيت. الخلايا بانيت تلعب دورا حاسما في محراب التي تدعم ISCS 8. بالإضافة إلى المنتجات جراثيم الخلايا بانيت تنتج جزيئات الإشارة التي تنشط مسارات التي تحكم التجديد ISC أو تمييز. وأظهرت دراسات سابقة أن Lgr5 + ISCS يمكن أن توجد فقط عندما يمكن أن تنافس على إشارات مكانة أساسية قدمتها ابنة الخلايا بانيت بها 8. وبحثت هذه الدراسات دور الخلايا بانيت على Lgr5 طبيعي + ISCS وليس في الحالة التي تكون فيها كانت معطوبة وتحتاج إلى التجديد من السكان Lgr5 لو.
<p الطبقة = "jove_content"> لفهم المرض البيولوجيا ونموذج الأمعاء ندرس الدور الوظيفي للخلايا و / أو الجينات باستخدام نماذج الماوس المعدلة وراثيا 9،10. في كثير من الأحيان هذه النماذج تستخدم التكنولوجيا لجنة المساواة العرقية، السلمون المدخن لتعديل مشروط الجين (ق) 9،10. لجنة المساواة العرقية (أسباب إعادة التركيب) recombinase هو recombinase محدد موقع الأسرة integrase، معزولة عن الجراثيم P1. لجنة المساواة العرقية يحفز إعادة التركيب موقع معين بين تعريف 34 بي بي " السلمون المدخن P "(موضع χ من التقاطع P1) مواقع. صممت الفئران وراثيا لتحتوي على مواقع LoxP أن الجناح المناطق ذات الاهتمام التي قصت على التعبير عن لجنة المساواة العرقية recombinase. ربط التعبير عن الجينات لجنة المساواة العرقية إلى خلية أو المروج محدد التنموي يسمح للتغيير إلى أن يتم بطريقة المكاني 9،10، وهذا مفيد بشكل خاص في التغلب على الطفرات المميتة الجنينية. وعلاوة على ذلك ربط التعبير لجنة المساواة العرقية إلى مسار مستقبل،التي يمكن تفعيلها بشكل مصطنع، تسمح التعديلات الزمنية.باستخدام هذه التكنولوجيا نحن المعطل الجين CatnB 11 في ظهائر المعوية. β-catenin، ومنتج الجين CatnB، هو المنظم الرئيسي للالكنسي مسار الإشارات WNT الذي يحكم التوازن ISC. دراستين السابقة باستخدام هذه الاستراتيجية أسفرت عن نتائج متضاربة 12،13. الدراسة التي Fevr وآخرون 12، تظاهر فقدان الخلايا الجذعية والتوازن في الأمعاء. في حين أن أيرلندا وآخرون. وذكرت الدراسة أن 14 في أعقاب انخفاض بقاء الخلية تم إسكانها محور سرداب-زغابة من خلايا نوع البرية معربا عن CatnB. كان الفارق كبيرا في هذه الدراسات المروج تستخدم للتعبير عن لجنة المساواة العرقية في ظهائر المعوية. وFevr وآخرون، واستخدمت الدراسة المروج villin جين مرتبط إلى مستقبلات هرمون الاستروجين والتي يمكن تفعيلها من خلال إدارة رamoxifen (VIL-لجنة المساواة العرقية-ER T2) 15،16. في المقابل أيرلندا وآخرون، الاستفادة من عنصر مروج للالسيتوكروم الفئران P450A1 (CYP1A1) الجينات لدفع لجنة المساواة العرقية التعبير في استجابة للأجنبي بيولوجيا β-naphthoflavone (آه لجنة المساواة العرقية). خصائص هذه النظم المختلفة ولدت اثنين من الفرضيات لتفسير هذه الملاحظات المختلفة. أول ما CatnB يتم حذف أكثر كفاءة في ISC باستخدام نظام T2 VIL-لجنة المساواة العرقية-ER مقارنة آه لجنة المساواة العرقية، مما يقلل من عدد من ISCS إلى مستويات إعادة تعمير الباطن. بدلا من ذلك أنه كان من المقرر في التمايز CatnB الحذف في السكان خلية متمايزة. وVIL-لجنة المساواة العرقية-ER نظام T2 أهداف كل الخلايا الظهارية من سرداب وزغابة في حين أن نظام آه لجنة المساواة العرقية يستهدف فقط الخلايا غير بانيت من مكانة ISC وسرداب. هذه الأنظمة توفر أدوات مثالية لدراسة behavIOR من ISCS وتفاعلها مع الخلايا بانيت. هنا نقدم عدة بروتوكولات مفصلة على أساس مدى استخدمنا هذه الأنظمة لتحديد أن الخلايا بانيت تلعب دورا حاسما في التوسط في استجابة الأمعاء إلى إصابة 17.
Protocol
وترد معلومات على جميع المواد المستخدمة في الجدول 1. وقد أجريت التجارب على الحيوانات فقط تحت سلطة ترخيص مشروع UK زارة الداخلية. 1. CatnB الحذف باستخدام آه لجنة المساواة العرقية وVIL-لجنة المساواة العرقية-ER أنظمة T2 عبور سلالات الفئران لتوليد 10-14 الأسبوع الأفواج القديمة آه لجنة المساواة العرقية + CatnB + / +، آه لجنة المساواة العرقية + CatnB flox / flox، VIL-لجنة المساواة العرقية-ER T2 CatnB + / + وVIL-لجنة المساواة العرقية-ER T2 CatnB flox / flox. لتحليل البصرية من إعادة التركيب، عبر وصمة عار -gal بيتا، وينبغي أن تتضمن الأفواج مراسل Rosa26R-lacZ 17. ، ينبغي تقدير حجم الأفواج المطلوبة الأفواج يجب أن يسيطر على وجود جينات واستخدام وكلاء التعريفي تعديلها باستخدام تحليل السلطة. للحث على التحوير آه لجنة المساواة العرقية إعداد β؛ -Naphthoflavone (BNF)، أو التحوير VIL-لجنة المساواة العرقية-ER T2 تاموكسيفين (TAM) في زيت الذرة لإعطاء حل العاملة من 10 ملغ / مل. ملاحظة: يجب أن يكون وزنه وكلاء في غطاء الدخان باستخدام الحماية الشخصية المناسبة. حلول الحرارة في زجاجة العنبر (BNF خفيف حساسة) إما 99.9 درجة مئوية لمدة BNF أو 80 درجة مئوية لمدة TAM في حمام مائي. نقل إلى النمام ساخنة وضعت في 100 درجة مئوية لمدة BNF، أو 80 درجة مئوية لمدة TAM، ويحرك المزيج لمدة 10 دقيقة. لBNF تكرار 1،3-1،4 حتى يذوب (يمكن اتخاذ> 1 ساعة). قسامة في زجاجات العنبر صغيرة (~ 5 مل) ثم تجميد في -20 ° C. يجب التخلص من الزجاجات بعد دورات 3 تجميد / الذوبان. قبل استخدام وكلاء ذوبان الجليد ويسخن إلى درجة حرارة مناسبة إذا كان قد سقط من الحل. السماح لتبرد إلى <37 ° C قبل الحقن. حقن الفئران داخل الصفاق (IP) مع جرعة من 80 ملغ / كغ، على سبيل المثال 25 غ الماوس يتلقى 0.2 مل من appropوكيل تحريض riate. لآه لجنة المساواة العرقية تقديم ثلاث حقن في فترة 24 ساعة، لVIL-لجنة المساواة العرقية-ER T2 إعطاء حقنة واحدة يوميا لمدة 4 أيام. 2. تشريح الأمعاء عن التصور مراسل والمناعية (IHC) الموت ببطء باستخدام الماوس خلع عنق الرحم من دون تخدير مسبق وفقا للموافقة الأخلاقية. ضع الماوس في موقف ضعيف والرطب الفراء باستخدام 70٪ ETOH، فتح تجويف داخل الصفاق طوليا على طول خط الوسط باستخدام المقص. تأمين المعدة مع ملقط وقطع الاتصال إلى المريء. إزالة الأمعاء الدقيقة يصل إلى تذييل عن طريق سحب بلطف على المعدة. إزالة الأمعاء الغليظة حتى فتحة الشرج عن طريق سحب بلطف على التذييل. مرة واحدة وقد تم عزل الأمعاء إزالة المعدة والتذييل. الأمعاء الاحمرار مع برنامج تلفزيوني 1X باستخدام حقنة مع حادة انتهت طرف ماصة. ملاحظة: يجب أن تكون كل الأمعاء طمعالجة mmediately لأحد التطبيقات المصب هو موضح أدناه. 3. الفورمالين التثبيت من الأمعاء قطع الأمعاء مسح إلى 3 أقسام متساوية الحجم، وتسمية القريبة والمتوسطة والبعيدة. قطع كل قسم إلى 1 سم قطعة. خذ شريط صغير من الشريط الجراحية 2 سم × 2 سم. وضع 04:57 1 سم قطع إلى منتصف الشريط الجراحية في تشكيل الهرم. إغلاق وختم الشريط حول القطع طوليا، لإعطاء "سجل كومة تأثير". وضع النسيج في وعاء مسطح القاع تحتوي على فائض كبير من محايد مخزنة تثبيتي الفورمالين، 10X ما لا يقل عن حجم تثبيتي لحجم الأنسجة. ملاحظة: تجنب وضع المبالغ الزائدة من الأنسجة داخل أنبوب للتثبيت، تقسيمه إلى حاويات متعددة. عينات من مكان في 4 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 18 – 24 ساعة قبل التضمين وباجتزاء. لمنع فقدان النووي β-catenin، لا إصلاح بعد 24 ساعة.بعد نقل تثبيت الأنسجة إلى حاوية القاع شقة تحتوي على فائض كبير من 70٪ ETOH، 10X ما لا يقل عن حجم الأنسجة. 4. Methacarn التثبيت من الأمعاء قبل تشريح إعداد methacarn مثبت من خلال الجمع بين 300 مل MeOH، 150 مل الكلوروفورم و 75 مل حمض الخليك الجليدي (4: 2: 1). قطع الأمعاء مسح إلى 3 أقسام متساوية الحجم القريبة والمتوسطة والبعيدة. وضع كل قطعة من الجانب الأمعاء إلى جنب على قطعة من ورق الترشيح (15 سم X15 سم) وباستخدام مقص springbow فتحه "أون الوجه. ضع الأمعاء ورقة الترشيح في طبق زجاجي يحتوي على methacarn لل3-24 ساعة على RT. بعد تثبيت التقاط نهاية قسم الأمعاء باستخدام ملقط. الرياح الأمعاء حول ملقط لتشكيل "سويس رول" وتأمين لفة من خلال فتح قليلا ملقط ووضع إبرة 25 G من خلال ذلك. وضع النسيج في وعاء مسطح القاع التي تحتوي على غرارRGE تتجاوز محايد مخزنة تثبيتي الفورمالين، 10X ما لا يقل عن حجم تثبيتي لحجم الأنسجة ومخزن لا يقل عن 1 ساعة قبل الشروع في المعالجة. 5. جبل كامل LacZ التصور (معدلة من شركة Marjou وآخرون. 18) إعداد لوحات الشمع عن طريق الجمع بين ralwax المنصهر مع الزيوت المعدنية بنسبة 10: 1. تصب في 15 أطباق بتري سم وتترك لتبرد. إعداد X-غال تثبيتي حسب الجدول 1 وتخزينها على الجليد. إزالة الأمعاء بأكملها وطرد خلال مع الثلج الباردة برنامج تلفزيوني 1X، كما في القسم 2. إصلاح الأمعاء عن طريق تنظيف مع 25 مل من الجليد الباردة X-غال مثبت. باستخدام مقص قطع الأمعاء إلى 3-5 أقسام متساوية (بحد أقصى 5 في لوحة). وضع كل قسم على لوحة الشمع وماهيتها نهاية كل ذلك ويمتد القسم قليلا مع العلوي خط المساريقي. تقليم أي مساريق الزائد. باستخدام مقص springbow قطع الوتر طوليا ويعلقون على طول الطريق.60؛ الفيضانات لوحة مع X-غال تثبيتي لتغطية الفروع ويترك لمدة 1 ساعة على الأقل في 4 درجات مئوية. إزالة X-غال تثبيتي باستخدام ماصة 25 مل ويغسل مرة واحدة مع 30 مل من برنامج تلفزيوني 1X. أقسام غطاء مع 30 مل من DTT الحل demucifying عن 30-60 دقيقة في RT، من الناحية المثالية على منصة هزاز. إزالة حل demucifiying باستخدام ماصة 25 مل والفيضانات لوحة مع 30 مل من برنامج تلفزيوني 1X. باستخدام ماصة باستور غسل أقسام الأمعاء مع برنامج تلفزيوني 1X في لوحة لإزالة المخاط. إزالة 1X PBS مع ماصة 25 مل والفيضانات مع 30 مل من X-غال وصمة عار. احتضان بين عشية وضحاها في RT في الظلام مع الإثارة لطيف على منصة هزاز. بعد الاختيار الحضانة بين عشية وضحاها أن أقسام قد وضعت زرقاء / خضراء وصمة عار، إذا كان لون الخلفية لا يزال الأبيض، يمكن إضافة الحل تلطيخ الطازجة ومراقبتها حتى تلطيخ يتطور. ملاحظة: بمجرد ملطخة أقسام ثم لا تلطيخ مزيد يمكن محاولة. إزالة وصمة عار X-غالباستخدام ماصة والفيضانات لوحة 25 مل مع 30 مل من برنامج تلفزيوني 1X ويترك لمدة 3 دقائق مع الإثارة لطيف. إزالة المسامير والتقاط، مع ملقط، نهاية قسم الأمعاء. الرياح الأمعاء حول ملقط لتشكيل "سويس رول"، وتأمين لفة من خلال فتح قليلا ملقط ووضع إبرة 25 G من خلال ذلك. وضع الأنسجة في بفوهة حاوية مسطحة القاع واسعة تحتوي على فائض كبير من محايد مخزنة تثبيتي الفورمالين، 10X ما لا يقل عن حجم تثبيتي لحجم الأنسجة. عينات من مكان في 4 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 24 ساعة قبل التضمين وباجتزاء. 6. استخراج الأقبية من الأمعاء عزل سم 20 الأولى من الأمعاء الدقيقة، كما في القسم 2. مكان الأمعاء على سطح تشريح نظيفة وباستخدام ملقط ومقص إزالة أي تعلق الدهون / مساريق. باستخدام مقص springbow فتح القناة الهضمية طوليا. باستخدام مجهر غطاء الشرائح، وirmly تتخلص من التجويف الأمعاء لإزالة الزوائد والمخاط. باستخدام مقص قطع الأمعاء إلى ~ 5 مم قطع ونقل في أنبوب 50 مل مع 25 مل 1X HBSS تستكمل مع البنسلين (100 U / مل)، والستربتومايسين (100 U / مل). احتضان لمدة 10 دقيقة في RT. إزالة المضادات الحيوية التي تحتوي على وسائل الإعلام عن طريق تمرير العينات من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر. وضع المقاطع المعوية في أنبوب 50 مل الطازجة التي تحتوي على 10 مل 1X HBSS واستبدال الغطاء. عكس بلطف مرتين وإزالة 1X HBSS عن طريق تمرير من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر. وعلاوة على ذلك غسل القطع المعوية بتكرار 6.4 و 6.5 ثلاث مرات والتأكد من أن الكسر الأخير هو واضح نسبيا. نقل الأنسجة لأنبوب 50 مل الطازجة التي تحتوي على 10 مل من EDTA (8 ملم) / 1X HBSS وترك في RT لمدة 5 دقائق. هزة بقوة (20 – 30X) أو دوامة، تمر عبر 70 ميكرومتر مصفاة الخلية والأنسجة نقل القطع لأنبوب 50 مل الطازجة التي تحتوي على EDTA (8 ملم) / 1X HBSS. ملاحظة:تدفق من خلال إما أن يتم تجاهل أو الاحتفاظ بها إذا كان المطلوب تحليل الزغب ظهائر. احتضان قطعة نسيج على الجليد لمدة 30 دقيقة، هز عينة بقوة (20 – 30X) أو دوامة. تمرير العينات من خلال مصفاة الخلية 70μm والإبقاء على تدفق من خلال لأن هذا يحتوي على الخبايا. نقل قطعة نسيج لأنبوب 50 مل الطازجة التي تحتوي على 10 مل من 1X HBSS. هزة بقوة (20 – 30X) أو دوامة، تمر من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر والإبقاء على التدفق من خلال. كرر واحدة لمزيد من الوقت لضمان استرداد الحد الأقصى من الخبايا من قطع المعوية. الجمع بين التدفق من خلال كسور وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق. تخلصي من طاف والإبقاء على بيليه سرداب. ملاحظة: الكريات يمكن استخدامها على الفور لزراعة (إن وجدت) أو تخزينها في -80 درجة مئوية قبل إجراءات استخراج DNA / RNA / البروتين القياسية. 7. معيار المناعى التصور قطع 5 μأقسام متر من البارافين الأنسجة جزءا لا يتجزأ من على بولي-L-ليسين (PLL) الشرائح. ملاحظة: ويرد بروتوكول قياسي لتلطيخ مع الأجسام المضادة B-catenin أدناه، يتم إعطاء المعلمات للأجسام أخرى في الجدول 2. دي الشمع مع 2X 3 دقائق يغسل في الحمامات الشريحة التي تحتوي زيلين الطازجة. ترطيب عن طريق تمرير الشرائح لمدة 3 دقائق عن طريق حمامات الشريحة التي تحتوي جديدة: 100٪ ETOH (2X)، 95٪ و 70٪ ETOH ETOH وأخيرا في برنامج تلفزيوني 1X. مكان الشرائح في حمام الشريحة التي تحتوي عازلة سيترات (الرقم الهيدروجيني 6) والحرارة 99.9 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لاسترداد المستضدات. تسمح الشرائح لتبرد ثم يغسل 3X 5 دقائق في حمام الشريحة التي تحتوي 1xTBS / T لمدة 5 دقائق. إزالة الشرائح من غسل الماضي، رسم على الفور في جميع أنحاء الأنسجة مع القلم PAP، وتغطي القسم مع كتلة التجاري الغلوثانيون أو 1.5٪ H 2 O 2 (في المقطر H 2 O). احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) ثم يغسل 3X في الحمامات الشريحة التي تحتوي 1X جديدة TBS / T لمدة 5 دقائق. بعد غسلجي أقسام غطاء، وذلك باستخدام ماصة، في 5٪ مصل الأرنب العادي (NRS) / 1xTBS / T لمدة 30 دقيقة في RT لمنع غير محددة مسعور ملزمة من الأجسام المضادة الأولية الخاصة بك. إزالة كتلة NRS مع ماصة والغطاء القسم باستور في-B catenin الأجسام المضادة الأولية المخفف 1: 200 مع 5٪ NRS. غسل الشرائح ل3X 5 دقائق في الحمامات الشريحة التي تحتوي 1xTBS جديدة / T. ملاحظة – سوف الأجسام المضادة أخرى تتطلب الأمثل لتخفيف وخصوصية. لضمان خصوصية الأجسام المضادة، يجب أن يتم تنفيذ أي الأجسام المضادة المناسبة ونمط إسوي البقع السيطرة. لا يوازيه أحد isotype السيطرة على الأنواع المضيفة ونمط إسوي من الأجسام المضادة الأولية الخاصة بك. تصور مع أي مجموعة الكشف HRP التجارية أو مع الأجسام المضادة المناسبة fluorescently المسمى الثانوي (الجدول 2). ملاحظة: طول التنمية يختلف عن كل الأجسام المضادة، لβ-catenin 10-15 ثانية وعادة ما يكفي. لتحسين التنمية لأول مؤسسة الأجسام المضادةablish طول الوقت اللازم لتصور خلايا إيجابية باستخدام الشرائح مراقبة إيجابية ومن ثم تطبيق هذا على كافة الشرائح اللاحقة. غسل الشرائح ل3X 5 دقائق في الحمامات الشريحة التي تحتوي جديدة TBS / T. مباين الشرائح عن طريق غمر في haematoxylin تحتوي على حمام شريحة ل~ 45 ثانية (غير مطلوب إذا باستخدام fluorescently المسمى الأجسام المضادة الثانوية). وضع الشرائح في حمام شريحة نظيفة وشطف مع ادارة مياه الصنبور ل~ 1 دقيقة، وضمان haematoxylin لا يتم غسلها تماما. يذوى الشرائح عن طريق تمرير من خلال حمامات الشريحة التي تحتوي زيادة تركيزات الكحول. 1X 30 ثانية في 70٪ ETOH، 1X 30 ثانية في 95٪ ETOH، 2X 30 يغسل ثانية في 100٪ ETOH، 2X 2 دقيقة في الزايلين. جبل ينزلق تحت ساترة باستخدام وسائل الإعلام التجارية المتزايدة. ملاحظة: في حالة استخدام الأجسام المضادة fluorescently المسمى جبل مع وسائل الإعلام التي تحتوي على دابي لتسمية النواة. 8. النسيجية تحديد Intestina محددةالخلايا الظهارية ل المعوية إعداد المقاطع باستخدام الباب 7 مع الأجسام المضادة villin والشروط الموضحة في الجدول 2. الخلايا المعوية الغدد الصماء (Grimelius وصمة عار 18،19). إعداد أقسام باتباع الخطوات 7،1-7،2. غسل الشرائح في حمام الشريحة التي تحتوي على الماء عالى النقاء لمدة 3 دقائق. نقل الشرائح إلى حمام الشريحة التي تحتوي مسخن حل الفضة (الجدول 1)، واحتضان عند 60 درجة مئوية لمدة 3 ساعات. إزالة الشرائح من الحل الفضة ومكان في حمام الشريحة التي تحتوي الطازجة حل المخفض مسخن (الجدول 2) في 45 ° C لمدة 3 دقائق. إزالة الشرائح ووضع في حمام الشريحة التي تحتوي على الماء عالى النقاء الطازجة لمدة 3 دقائق. اتبع الخطوات من 7،6-7،8 من الباب 7. الخلايا الكأسية (الألسيان الأزرق وصمة عار). إعداد المقاطع التي كتبها الخطوات التالية 7،1-7،2 .. الشرائح نقل إلى حمام الشريحة التي تحتوي الألسيان أزرق درجة الحموضة 2.5 لمدة 5 دقائق على RT. إزالة وصمة عار الزرقاء الألسيان مع ماصة والمكان حمام الشريحة تحت الصنبور لتشغيل 3-5 دقيقة. اتبع الخطوات 7،6-7،8. ملاحظة: الحل الأزرق الألسيان يمكن الاحتفاظ بها لاستخدامها مرة أخرى. ISCS. للتعرف على ISCS اتبع الباب 9. خلايا بانيت. إعداد أقسام قسم 7 باستخدام الأجسام المضادة الليزوزيم والشروط الموضحة في الجدول 2 التالي. 9. في الموقع كشف RNA مع الفئران الأمعاء 19-21 وضع 5 ميكرون مقاطع من الفورمالين الأمعاء الثابتة (القسم 3) على الشرائح PLL. إعداد digoxigenin المسمى RNA التحقيق خطي للكشف عن Olfm4 التعبير 21. Dewax وترطيب أقسام حسب القسم 7. ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ هذا البروتوكول في بيئة خالية ريبونوكلياز لمنع تدهور التحقيق RNA. رسم حول رقضية بالقلم PAP للحد من الكواشف. احتضان المقاطع في حمام الشريحة مع 6٪ H 2 O 2 (في المقطر H 2 O) لمدة 30 دقيقة. يغسل مرتين في حمام الشريحة مع الطازجة برنامج تلفزيوني 1X لمدة 3 دقائق. تجاهل 1X PBS و، وذلك باستخدام ماصة، القسم الغطاء مع 4٪ لامتصاص العرق لمدة 20 دقيقة على الجليد. يغسل مرتين في حمام الشريحة مع الطازجة برنامج تلفزيوني 1X لمدة 3 دقائق. باستخدام أقسام غطاء ماصة مع الحل بروتين K لمدة 5 دقائق في حمام غسل الشريحة مع الطازجة برنامج تلفزيوني 1X لمدة 3 دقائق. باستخدام ماصة أقسام ما بعد الإصلاح من خلال تغطية في 4٪ امتصاص العرق لمدة 5 دقائق على RT. يغسل في حمام الشريحة مع DEPC المعالجة H 2 0 لمدة 2 دقيقة. باستخدام أقسام غطاء ماصة في حل أنهيدريد الخل لمدة 10 دقيقة مع الإثارة. يغسل في حمام الشريحة مع الطازجة برنامج تلفزيوني 1X / 3 دقيقة، تليها 1X المالحة / 3 دقيقة. تمرير الشرائح من خلال حمامات تحتوي على زيادة تركيزات الكحول. 1X 30 ثانية في 70٪ ETOH، 1X 30 ثانية في 95٪ ETOH، 2X 30 يغسل ثانية في طازجة 100٪ ETOH،2X 2 دقيقة في زيلين جديدة والسماح للهواء الجاف. تمييع التحقيق Olfm4 1: 100 العازلة في التهجين وتفسد التحقيق عن طريق التسخين إلى 80C لمدة 3 دقائق. تطبيق 100 ميكرولتر من التحقيق على كل قسم، وتغطي مع parafilm لمنع الجفاف من الشريحة. احتضان بين عشية وضحاها في، غرفة رطبة مظلمة عند 65 مئوية. يغسل في حمام الشرائح مع 5 × SSC عند 65 مئوية لمدة 15 دقيقة. غسل المقاطع في حمام الشريحة مرتين مع الطازجة الفورماميد 50٪ / 5 × SSC / 1٪ SDS لمدة 30 دقيقة في 65 مئوية. غسل أقسام مرتين في حمام الشريحة في PBT الطازجة لمدة 10 دقيقة، الأولى في 65 ج والثانية في RT. باستخدام أقسام غطاء ماصة مع PBT تحتوي على 25 ميكروغرام ريبونوكلياز لمدة 45 دقيقة عند 37 مئوية. غسل المقاطع في حمام الشريحة في PBT لمدة 5 دقائق على RT. غسل المقاطع في حمام الشريحة مرتين مع الطازجة الفورماميد 50٪ / 5 × SSC لمدة 30 دقيقة في 65 مئوية. لمنع والأقسام غطاء باستخدام ماصة مع 10٪ مصل الأغنام في PBT وتخزينها في الظلام، وزارة الداخليةالحادي غرفة في RT ل2-3 ساعة. إعداد الأجسام المضادة عن طريق تمييع لمكافحة digoxigenin الفوسفاتيز القلوية مترافق الأجسام المضادة في 1: 500 مع 10٪ مصل الأغنام في PBT تحتوي على 5 ملغ / مل مسحوق الماوس المعوية. احتضان لمدة 3 ساعات في 4 درجات مئوية في الظلام على منصة هزاز. تدور باستمرار لإزالة مسحوق الأمعاء الزائدة وإضافة وحدات بصري 3x من 1٪ مصل الأغنام في PBT لطاف. إزالة كتلة من الشرائح مع ماصة وإضافة 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة لكل قسم، وتغطي مع parafilm واحتضان في، غرفة رطبة مظلمة في 4 درجات مئوية خلال الليل. غسل المقاطع في حمام شريحة 3 × مع PBT الطازجة لمدة 5 دقائق. لمنع غسل المقاطع في حمام شريحة 3 × مع العازلة NTMT الطازجة لمدة 5 دقائق. تصور، وذلك باستخدام ماصة تغطي كل قسم مع BM الأرجواني واحتضان في الظلام في RT ل24-72 ساعة حتى يتطور لون قوي بما فيه الكفاية. غسل المقاطع في حمام الشرائح مرة واحدة في PBT ومباين عن طريق غمر في يوزين لمدة 1 دقيقة. ريمولقد يوزين الزائد عن طريق أقسام الغسيل في حمام الشريحة تحت المياه الجارية لمدة 3-5 دقيقة. تزج الشرائح في الزيلين والسماح للهواء الجاف. جبل تحت ساترة باستخدام وسائل الإعلام التجارية. 10. النسيجية توصيف المعوية الظهارة وضع 5 ميكرون المقاطع من الأنسجة الثابتة (القسم 3 و 4) على الشرائح PLL. تحليل ≥25 كلها العشوائي (أو ≥50 نصف) الأقبية من ≥4 الفئران من كل فوج لكل من المعلمات التالية. ملاحظة: للحفاظ على الاتساق تحليل الخبايا من نفس الموقع من كل الأمعاء (فقط استخدام الطرف القريب). المعلمات الخلوية من معيار H & E أقسام الملون (ما لم ينص على خلاف ذلك): عدد سرداب، والطول، موت الخلايا المبرمج والانقسام. عدد سرداب. استخدام التكبير المنخفض الطاقة (على سبيل المثال 4X أو 10X) لحساب عدد من الخبايا يدويا في اتصال مع الطبقة القاعدية. عد ≥10 عرضية الداني الأمعاء الطائفةالأيونات من 4 على الأقل الفئران. ارتفاع سرداب. استخدام التكبير الطاقة العالية (على سبيل المثال 20X 40X أو) لحساب عدد الخلايا يدويا من الجزء السفلي من سرداب إلى سرداب / زغابة محور (الشكل 3B). موت الخلايا المبرمج 22، 23. الأسلوب 1: استخدام التكبير الطاقة العالية (20X 40X أو على سبيل المثال.) لحساب عدد الخلايا أفكارك يدويا في كل سرداب. يمكن التعرف على الخلايا أفكارك التي كتبها انكماش الخلية، والتكثيف لونين، وتشكيل الفقاعات حشوية والهيئات أفكارك (الشكل 3A). طريقة 2: إجراء وصمة IHC (المادة 7) لكاسباس 3 باستخدام الشروط المبينة في الجدول رقم 2 عن طريق التكبير الطاقة العالية (20X أو 40X على سبيل المثال.) العد يدويا عدد الخلايا إيجابية في كل سرداب ل quantitate الخلايا في الجسم. مرحلة التنفيذ من موت الخلايا المبرمج. الانقسام. <ol> استخدام التكبير الطاقة العالية (على سبيل المثال 20X 40X أو) لحساب عدد الخلايا الإنقسامية يدويا في كل سرداب. الخلايا الإنقسامية تحتوي على تكثيف مادة DNA وعادة ما تكون متماثل ومنسق بشكل جيد (الشكل 3B). انتشار الأسلحة النووية. إجراء IHC (المادة 7) وصمة عار لكي-67 باستخدام الشروط المبينة في الجدول رقم 2. عدد الخلايا إيجابية يدويا ل quantitate نسبة الخلايا المتكاثرة سرداب.
Representative Results
مقارنة ISC التوحد الكفاءة في آه لجنة المساواة العرقية وفيل-لجنة المساواة العرقية-ER أنظمة T2 استخدام هذه الأنظمة لجنة المساواة العرقية، السلمون المدخن لتقييم دور الخلايا بانيت، في إعادة إسكانها الأمعاء التالية الضرر، وتوصيف المطلوب من كفاءة إعادة التركيب داخل ISCS. باستخدام مراسل المشروط Rosa26R-lacZ أثبتنا أن في كلا النظامين 3 آخر أيام الاستقراء (نقطة في البوصة) هناك ~ 100٪ إعادة التركيب في الأمعاء الدقيقة (الشكل 1A). Quantitating وجود أليل معاد من قبل QPCR كان مرتبك من الاختلافات في أنماط التعبير لجنة المساواة العرقية بين النظم. أظهر نظام T2 VIL-لجنة المساواة العرقية-ER على 3.53 أضعاف في وجود أليل معاد بالمقارنة مع النظام آه لجنة المساواة العرقية، وذلك بسبب تعبيرها في نسبة أكبر من epitheli16. للتغلب على هذه اعتمدنا استراتيجية مختلفة التي سمحت لنا لمقارنة مباشرة النظم. نحن الناجم عن الفئران مع الأنظمة الحث المختلفة وتحليلها على 30 نقطة في البوصة، الذي الخبايا إيجابية نقطة LacZ وزغابة تمثل حدثا إعادة التركيب ISC. باستخدام هذا النهج أثبتنا أن في كلا النظامين، 3 حقن حمل وكيل (تسليم IP في 80 مغ / كغ في 24 ساعة)، معاد في عدد مساو من ISCS على الرغم من مستويات إعادة التركيب الأولية كونها أكبر بكثير في VIL-لجنة المساواة العرقية-ER T2 نظام 16 (الشكل 1B-د). وعلاوة على ذلك، وذلك باستخدام الحمض النووي المستخرج من الخبايا معاد، أظهرت QPCR لالأليلات معاد زيادة غير كبيرة في إعادة التركيب باستخدام VIL-Cre- نظام ER T2، ويحتمل أن يرجع ذلك إلى إعادة التركيب في خلايا بانيت لم يلاحظ استخدام نظام آه لجنة المساواة العرقية (1D الشكل). وعلاوة على ذلك، وتلطيخ لأنواع الخلايا الطلائية لم يكن إينديكيت أي تغيير في نمط التمايز، صور تمثيلية من كل نوع من الخلايا التحقيق هو مبين في الشكل 2E-2H. توصيف المعوية الظهارة يلي CatnB الحذف تقدير حجم الخسارة سرداب تميز حركية إعادة التركيب في هذه الأنظمة لجنة المساواة العرقية مكنتنا من تحليل الأمعاء الماوس عند معاد أرقام يعادل ISCS. باستخدام مراسل LacZ أظهرت كلا النظامين خسارة كاملة للمعاد (الأزرق) الخلايا في 3 نقطة في البوصة (الشكل 2A). كما ذكرت سابقا بعد ثلاثة أيام حذف CatnB أظهرت الفئران آه لجنة المساواة العرقية فقدان سرداب جزئية، في حين أن الفئران T2 VIL-لجنة المساواة العرقية-ER أظهرت التدمير الكامل للسرداب / زغابة محور 13،16،24 (الشكل 2B-د). </p> ديناميات الظهارية إعادة تعمير باستخدام التقنيات المذكورة أعلاه وتتميز نحن معلمات متعددة لتمكيننا من فهم هذه الملاحظة. صور تمثيلية من المعلمات وأنواع الخلايا تحليلها باستخدام بروتوكولات 7-10 ترد في (الشكل 3A و 3B). لفترة وجيزة، كانت الخسائر في أقبية تتفق مع مستويات مرتفعة من موت الخلايا المبرمج عرضه في كلا النظامين (الشكل 3E). إلا أن الانقسام والانتشار، ارتفاع الخلوي سرداب، سرداب والتعبير (لا يظهر) البيانات وأشار أن النظام آه لجنة المساواة العرقية على التعافي، ويفترض نظرا لإعادة تعمير من قبل ISCS-معاد للأمم المتحدة (الشكل 3C). في مقارنة صارخة، فشل VIL-لجنة المساواة العرقية-ER T2 لاسترداد رغم احتفاظ الخلايا الظهارية سرداب (الشكل 3D). توصيف الظواهر الخلوية داخل القبو أن نفهم لماذا الخبايا من الفئران آه جنة المساواة العرقية، ويمكن إعادة ملء حين أن VIL-لجنة المساواة العرقية-ER T2 لا يمكننا أن تتميز الخلايا الظهارية بعد حذف CatnB ثلاثة أيام. باستخدام التهجين الموضعي (المادة 9)، وتحليل IHC (الباب 7، 8 و 10) في أثبتنا أن الخلايا سرداب في VIL-لجنة المساواة العرقية-ER T2 CatnB flox / الفئران flox كانت غير التكاثري، وتفتقر إلى التعبير عن علامة ISC Olfm4 ، على عكس الخبايا في الفئران آه جنة المساواة العرقية (الشكل 4C و و). كما توصيف الأولي قد أثبتت أن إعادة التركيب في أقبية كان يعادل انتقلنا إلى دراسة دور الخلايا بانيت. أجرينا الفلورسنت المزدوج IHC ضد CatnB وLyz1 لتحديد الخلايا التي فقدت بيتا catenin وسواء كانوا خلايا بانيت (الشكل 5A-5C). كما هو موضح سابقا نحن دemonstrated أن جميع خلايا سرداب تستهدف استخدام نظام T2 VIL-لجنة المساواة العرقية-ER. مقارنة يدخر النظام آه لجنة المساواة العرقية الخلايا بانيت وظهائر زغابة. كانت خلايا بانيت مزيد من احظ فقط تمر موت الخلايا المبرمج بعد CatnB الحذف باستخدام نظام T2 VIL-لجنة المساواة العرقية-ER (الشكل 5D & 5E). الشكل 1: مقارنة بين النوعية والكفاءة من لجنة المساواة العرقية / السلمون المدخن التوحد داخل الأمعاء الظهارة باستخدام آه لجنة المساواة العرقية وفيل-لجنة المساواة العرقية-ER أنظمة T2 (أ): تصور آه لجنة المساواة العرقية مراسل LacZ التعبير في wholemount صغير (SI. * النهاية البعيدة) والكبيرة (LI؛ * النهاية البعيدة) من نوع الماوس البرية. (ب): نتائج QPCR تغير الاداء أضعاف لمعاد CatnB flox أليل في 1 نقطة في البوصة للمقارنة بين الأنظمة تحريض مختلفة في آه لجنة المساواة العرقية CatnB flox / flox (BNF الناجم) وVIL-لجنة المساواة العرقية-ER T2 CatnB flox / flox (TAM التي يسببها )؛ * P> 0.05 (مان-ويتني [2-ذيل] مقارنة التحكم). (ج) – (ه):. الأمعاء الدقيقة Wholemount تظهر LacZ سرداب إيجابي 30 نقطة لكل بوصة لوحة (ب) – (ه) معدلة من باري وآخرون 16 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2: مقارنة بين آه لجنة المساواة العرقية وفيل-لجنة المساواة العرقية-ER T2 <stron ز> نظم مشروطة حذف CatnB في الأمعاء الظهارة (أ): الأمعاء الدقيقة Wholemount فقدان تظهر الخلايا معاد في آه لجنة المساواة العرقية CatnB flox / flox LacZ + الفئران على مدى 3 أيام. (ب): الكمي لفقدان سرداب بعد 3 أيام حذف CatnB. * P> 0.05 (مان-ويتني [2-ذيل] مقارنة التحكم). (ج & د): عرضية H & E المقاطع من الفورمالين الأمعاء الثابتة يدل فقدان الخبايا بعد CatnB الحذف. (ه) – (ح) مثال من أنواع الخلايا من السيطرة على الفئران: (ه) الخلايا المعوية endocriine، (و) الخلايا الكأسية، (ز) CatnB IHC مما يشير إلى ISC (→) مع النووي B-catenin و(ح) بانيت الخلايا. لوحة (ب) تعديل من باري وآخرون. 16. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. <p class="jove_content" fo:keep-to gether.within صفحة = "دائما"> الرقم 3: توصيف ظهور النمط الظاهري عند استخدام آه لجنة المساواة العرقية وفيل-لجنة المساواة العرقية-ER أنظمة T2 لمشروطا حذف CatnB في أرقام مماثلة ISCS داخل الأمعاء الظهارة الصغيرة (أ و ب) H & E الفورمالين الملون الأبواب الثابتة تشير إلى موقع سرداب. ارتفاع ([])، وأفكارك (←) والخلايا الإنقسامية (↓). الكمي من متوسط عدد الخلايا في سرداب بين النوع البري (الأزرق) وCatnB flox (برتقالي) الفئران في ثلاث نقاط الوقت (نقطة في البوصة) (ج) ارتفاع سرداب، (د) الانقسام و (ه) موت الخلايا المبرمج (أشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري ). لوحة (ج) – (ه) معدلة من باري وآخرون 16.3429fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4: مقارنة بين خصائص ISC باستخدام آه لجنة المساواة العرقية وفيل-لجنة المساواة العرقية-ER أنظمة T2 لمشروطا حذف CatnB في الأمعاء الدقيقة الظهارة الظهارية خلايا سرداب بعد 3 أيام حذف CatnB باستخدام آه لجنة المساواة العرقية (AC) أو بنيت فيالت لجنة المساواة العرقية-ER T2 (مدافع) النظام. (أ و د) H & E قسم تظهر مناطق من فقدان سرداب. (ب و د) كي-67 IHC فقدان التظاهر من خلايا التكاثري باستخدام VIL-لجنة المساواة العرقية-ER T2. (C & F) Olfm4 في الموقع مما يدل على وجود ISCS الوظيفية باستخدام آه لجنة المساواة العرقية. لوحة (أ) – (و) المعدلة من باري وآخرون 16 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الرقم 5: توصيف خلايا بانيت بعد CatnB الحذف باستخدام نظم T2 فيل-لجنة المساواة العرقية-ER وآه لجنة المساواة العرقية (ميلان): صور المناعي من الخبايا تظهر بانيت الخلية (الحمراء)، B-catenin (الخضراء) ونواة (الأزرق )، سهم يشير غشاء ملزمة بيتا catenin. (دي) IHC لكاسباس 3 يشير إلى خلايا بانيت أفكارك هي غائبة في آه لجنة المساواة العرقية (د) ولكن موجودة في النظام VIL-لجنة المساواة العرقية-ER T2 (ه). لوحة (أ) – (ه) معدلة منباري وآخرون 16. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. العازلة خلات * * لجعل 100 مل: 4.8 مل 0.2 M حمض الخليك، 45.2 مل 0،2 M الصوديوم خلات و 50 مل الماء المقطر حمض الاسيتيك فيشر العلمية C / 0400 / PB17 أنهيدريد الخل سيغما A6404 الحل أنهيدريد الخل * * 2 M الخليك أنهيدريد في 0.1 M ثلاثي إيثانول أمين هيدروكلوريد الألسيان الأزرق سيغما A5268 الألسيان الأزرق PH 2.5 * * </tد> لجعل 500 مل: 15 مل حمض الخليك والماء 5 ز الألسيان الأزرق و485 مل المقطر لمكافحة digoxigenin الفوسفاتيز القلوية الضد مترافق Abcam ab119345 B (بيتا) -Naphthoflavone سيغما N3633 BNF، وضخ دون السماح للحل لتبرد كثيرا لمجمع ستنخفض من الحل. الحل يمكن إعادة استخدامها – مخزن في -20 ° C بين الاستخدامات، لا يسخن أكثر من مرتين. Bloxall ناقلات مختبرات SP-6000 BM الأرجواني روش 11442074001 BSA سيغما A4503 ألبومين المصل البقري الكلوروفورم فيشر العلمية C / 4920/17 سترات العازلة / مستضد نزع القناع الحل ناقلات مختبرات H-3300 زيت الذرة سيغما C8627 حل Demucifiying * * 500 مل: 50 مل الجلسرين، 50 مل تريس 0.1M pH8.8، 100 مل ETOH، 300 مل المالحة (0.9٪ كلوريد الصوديوم في الماء)، DTT 1.7 غرام. ويمكن إجراء حل Demucifying مسبقا وتخزينها، ولكن DTT شولد أن تضاف قبل الحضانة (340 ملغ / 100 مل). DEPC المياه المعالجة تكنولوجيا الحياة 750023 DTT سيغما 101509944 EDTA سيغما O3690 0.5 M الإيثانول فيشر العلمية E / 0650DF / 17 ورق الترشيح هتما 3000917 الفورمالديهايد سيغما F8775 الفورمالين محلول مائي سيغما SLBL11382V محايدة مخزنة الفورمالين الفورماميد سيغما F5786 Glutaraldehye سيغما G6257 H 2 O 2 سيغما 216763 Haematoxylin ريمون خروف 12698616 HBSS GIBCO 14175-053 HBSS (-MgCl2 +؛ -CaCl2) العازلة التهجين * * 5 × SSC، 50٪ الفورماميد، 5٪ SDS، 1 ملغ / مل الهيبارين، 1 ملغ / مل العجل الحمض الريبي النووي النقال الكبد الهيدروكينون سيغما H9003 ImmPACT DAB البيروكسيد ناقلات مختبرات SK-4105 <tr> Immpress HRP المضادة للماوس مفتش كيت ناقلات مختبرات MP-7402 Immpress HRP المضادة للأرنب مفتش كيت ناقلات مختبرات MP-7401 مسحوق الأنسجة المعوية * * تم الجمع بين الأمعاء الدقيقة من 5 فئران بالغة والمتجانس في الحد الأدنى للحجم الجليد الباردة PBS. تم إضافة 4 مجلدات من الأسيتون الجليد الباردة إلى الأمعاء المتجانس، الذي يخلط جيدا وحضنت على الجليد لمدة 30 دقيقة. تم طرد هذا وغسلها بيليه استخدام الأسيتون الجليد الباردة. كان هذا أيضا طرد وبيليه الناتجة تنتشر على ورقة الترشيح ويترك ليجف. مرة واحدة تجف تماما ووضع حد لاستخدام مواد لمسحوق ناعم باستخدام مدقة وقذائف هاون. K-فروسيانيد سيغما P-3667 K-فيروسيانيد سيغما P3289 </tr> الليفاميزول سيغما L0380000 Methacarn * * 60٪ الميثانول: 30٪ الكلوروفورم: 10٪ حمض الخليك الميثانول فيشر العلمية M / 4000/17 MgCl2 سيغما M8266 مصل الماعز العادي ناقلات مختبرات S-1012 NGS مصل الأرنب العادي داكو X0902 NRS NTMT * * 100 ملي كلوريد الصوديوم، و 100 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك، 50 ملي MgCl2، 0.1٪ Tween20، 2 مم الليفاميزول PAP القلم ناقلات H-400 امتصاص العرق سيغما P6148 PBT * * 0.5 M كلوريد الصوديوم، و 10 ملي TrisHCL الرقم الهيدروجيني 7.5، 0.1٪ توين 20 البنسلين / الستربتوميسين GIBCO 15140-122 100X solutiuon. الفوسفات مخزنة المالحة (10X) فيشر العلمية BP3994 Dilluted 01:10 مع الماء المقطر لجعل 1X شرائح PLL سيغما P0425-72EA شرائح المجهر بولي-L-ليسين بروتين K سيغما P2308 حل بروتين ك * * تمييع بروتين K في 200 ميكروغرام / مل في 50 ملي تريس، 5 ملي EDTA. Ralwax BDH 36154 7N المخفض الحل * * لجعل 100 مل: 1 ز هيدروكينون، 5 ز سلفيت الصوديوم و 100 مل من الماء المقطر RnaseA سيغما R6148 </td> ملحي * * 0.9٪ كلوريد الصوديوم في الماء المقطر SDS سيغما I3771 مصل الأغنام سيغما S3772 نترات الفضة سيغما S / 1240/46 الحل الفضة * * لجعل 100 مل: 10 مل العازلة خلات، 87 مل من الماء المقطر، 3 مل 1٪ نترات الفضة أسيتات الصوديوم فيشر العلمية S / 2120/53 كلوريد الصوديوم سيغما S6753 كلوريد الصوديوم كبريتيت الصوديوم سيغما 239321 SSC سيغما 93017 20x وسيترات الصوديوم المالحة الشريط الجراحية فيشر العلمية 12960495 تاموكسيفين سيغما T5648 TAM، وضخ دون السماح للحل لتبرد كثيرا لمجمع ستنخفض من الحل. الحل يمكن إعادة استخدامها – مخزن في -20 ° C بين الاستخدامات، لا يسخن أكثر من مرتين. TBS / T تشوير الخلية # 9997 ترايثولامين هيدروكلوريد سيغما T1502 تريس، HCL إينفيتروجن 15567-027 Tween20 سيغما TP9416 VectaMount ناقلات مختبرات H-5000 VectaShield Hardset تصاعد المتوسطة مع دابي ناقلات مختبرات H-1500 Vectastain ABC كيت Vectأو مختبرات PK-4001 X-غال PROMEGA V3941 X-غال تثبيتي * * 2٪ الفورمالديهايد، 0.1٪ غلوتارالدهيد في 1XPBS X-غال وصمة عار * * X-غال وصمة عار. 200 ميكرولتر X-غال (A) في 50 مل من محلول B (0،214 ز MgCl2، 0.48 ز K-فروسيانيد، 0.734 غرام K-فيروسيانيد في 500 مل PBS). ويمكن إجراء حل B يصل oin مسبقا وتخزينها في 4 درجات مئوية زيلين فيشر العلمية X / 0200/21 الجدول 1: المواد والأساليب الهدف بيتا Catenin الليزوزيم Ki67 كاسباس 3 Villin مصدر تجاري من أب الأساسي تنبيغ مختبرات Neomarkers ناقلات مختبرات أنظمة R & D سانتا كروز عدد كتالوج 610154 RB-372 VP-K452 AF835 SC-7672 رفع أب الابتدائية في الماوس (ماب) أرنب (PAB) الماوس (ماب) أرنب (PAB) الماعز (PAB) استرجاع مستضد حمام ماء يغلي / السيترات العازلة حمام ماء يغلي / السيترات العازلة حمام ماء يغلي / السيترات العازلة حمام ماء يغلي / السيترات العازلة حمام ماء يغلي / السيترات العازلة كتلة الغلوثانيون Bloxall أو 2٪ H 2 O 2، 45 ثانية Bloxall أو 1.5٪ H 2 O 2، 30 دقيقة Bloxall أو 0.5٪ H 2 O 2 و 20 دقيقة Bloxall أو 2٪H 2 O 2، 45 ثانية Bloxall أو 3٪ H 2 O 2 و 20 دقيقة كتلة المصل 1٪ BSA، 30 دقيقة 10٪ NGS، 30min في 20٪ NRS، 20 دقيقة 10٪ NGS، 45 دقيقة 10٪ NRS، 30 دقيقة غسل العازلة PBS TBS / T TBS / T PBS TBS / T شروط أب الأساسي 1/300، 2 ساعة على RT 1/100، 1hr في RT 1/50، 1hr في RT 1/750، س / ن ب 4 ° C 1/500، 1hr في RT أب الثانوي Immpress HRP المضادة للماوس مفتش كيت Immpress HRP المضادة للأرنب مفتش كيت الأرنب المعقدة البيروكسيديز المضادة للماوس البيروكسيديز الماعز المضادة للأرنب الأرنب المعقدة البيروكسيديز مكافحة الماعز شروط أب الثانوي 1 ساعة على RT 30min في في RT <t د> 1/200، و 30 دقيقة في RT 1/200، 30 دقيقة في RT 1/200، 30 دقيقة في RT تضخيم الإشارات N / A N / A ABC عدة ABC عدة ABC عدة الكشف عن إشارة ImmPACT DAB البيروكسيد ImmPACT DAB البيروكسيد ImmPACT DAB البيروكسيد ImmPACT DAB البيروكسيد ImmPACT DAB البيروكسيد المناعي الأجسام المضادة Alexafluor 488 Alexafluor 594 N / A N / A N / A خصائص المناعي الإثارة ماكس 488 / الانبعاث ماكس 525 الإثارة ماكس 595 / الانبعاث ماكس 617 تعيين تصفية المشترك FITC تكساس الأحمر محتوى "> الجدول 2: IHC الأجسام المضادة والشروط
Discussion
باستخدام مشروطة، لجنة المساواة العرقية السلمون المدخن الفئران المعدلة وراثيا لتشريح وظيفة الجينات والخلايا هو النهج الأكثر استخداما. وقد استخدمت هذه النماذج نجاحا كبيرا في الأمعاء لتحديد وتوصيف الخلايا الجذعية 2،4-6 وفهم دورها في مرض 25. ولتحقيق الاستغلال الأمثل هذه النماذج يتطلب توصيف شامل لنظام لتمكين البيانات إلى أن تفسر بشكل صحيح. وفهم كامل لهذه الأنظمة من الصعب تحقيق ذلك بسبب الجينات نادرا ما يجري محددة لنوع من الخلايا الانفرادي أو الموقع، ونقص في المعرفة البيولوجية وعدم كفاءة الأنظمة المستخدمة للحث على لجنة المساواة العرقية التعبير. الأساليب المذكورة هنا شرح كيفية نتغلب على هذه القضايا من خلال التصميم التجريبي وتطبيق المعارف القائمة. على الرغم من أننا تستخدم هذه الطرق للإجابة على سؤال بحثي محدد التقنيات المعروضة هنا هي عامة ويمكن استغلالها لأي بحث التحقيق في موريالأمعاء ني.
إعداد الأنسجة المعوية
في خطوة حاسمة لضمان تحقيق نتائج قوية هي حصاد وتجهيز الأنسجة، والتي تحتاج إلى معالجتها في الوقت المناسب بطريقة وتثبيت بروتوكولات التقيد التام بها. المصب ويمكن أن يعزى القضايا على النحو تقريبا كل كبيرة على القطع الأثرية المرتبطة تجفيف الأنسجة خارج و / أو التثبيت غير مكتملة. توقيت حاسم لمنع تدهور بنية الأنسجة و / أو الأحماض النووية والبروتينات. تثبيت ناقصة أو مماحكة يمكن أن يؤدي إلى فقدان القرار النسيجية. تثبيت يرجع لضيق الوقت أو أبواب سميكة جدا للسماح اختراق تثبيتي يمكن أن يؤدي إلى فقدان القرار في غضون الخبايا المعوية التي يمكن ملاحظتها بأنه "علامة المد" على تحليل IHC غير مكتملة. وعلاوة على ذلك فمن الأهمية بمكان أن التثبيت لا تمتد لفترة طويلة جدا، كما النووي β-catenin يمكن منتشر من نواة إلا الموالية فوراcessed والشمع جزءا لا يتجزأ من بعد التثبيت الفورمالين.
دور الخلايا بانيت في محراب ISC
البيانات المقدمة هنا تظهر بشكل فعال على أهمية خلايا بانيت في سرداب تجديد في الأمعاء الكبار بعد خسارة ISC. ومع ذلك لا يزال هناك احتمال أن آه لجنة المساواة العرقية قطع الغيار يبلغ عدد سكانها ISCS أن VIL-لجنة المساواة العرقية-ER أهداف T2. تيان وآخرون 26 أثبتت بأناقة أن ISCS مرحبا Lgr5 يتم استبدال من قبل سكان Lgr5 لو ISCS الاحتياطي. ويبدو من المرجح أن هذه ISCS ويدخر في النظام آه لجنة المساواة العرقية بسبب السكان الاحتياطي بعد أن تم التعرف على السلائف الخلية إفرازية 6،7 الآن. تبقى أهمية للخلية بانيت ناضجة في دعم هذه السلائف الخلية الإفرازية عند الحاجة للعودة إلى حالة ISC إلى إجابة. كما تشكل خلايا بانيت وISC مكانة 8 ولعب الأدوار في تنظيم الاستجابات ISC إلى السعرات الحرارية 27 و 28 التهاب أنه لا يزال من المحتمل أن ظائف التمريض فيها ستمتد إلى السلائف الخاصة بها.
مقاربات وتقنيات فعال نموذج الإنسان سرطان القولون والمستقيم جديدة
أدى اكتشاف ISC إلى تحديد الجينات التي تستخدم حاليا لتوليد نماذج الماوس جديدة للتحقيق في دور الجينات والخلايا في الأحياء المعوية والأمراض، التي استعرضتها كلارك وآخرون 9. القيود الوحيدة لهذا الأسلوب هو التعرف على الجينات للتعبير عن البروتين لجنة المساواة العرقية. حاليا يتم التحقيق ISCS بشكل روتيني باستخدام الفئران المعدلة وراثيا المشروطة استنادا إلى نمط التعبير الجيني Lgr5. وقد استخدمت الفئران التي تعبر عن لجنة المساواة العرقية من المروج Lgr5 حذف APC، والجين المتحور الأكثر شيوعا في سرطان القولون والمستقيم (CRC)، مما يدل على ISC باعتبارها الخلية من أصل 25. حذف انتقائي الجينات CRC أخرى في هذه الخلايا هو توفير نظرة ثاقبة تطور المرض وانتشر على سبيل المثال. PTEN 29. يتم استرداد مزيد من التبصر وظيفة ISC من قبل ablating تحديدا Lgr5 -expressing الخلايا في الفئران باستخدام الخناق البشري السم مستقبلات طرقت (DTR) الجين في موضع Lgr5 26. استخدام استراتيجيات أخرى للنظام تيت-O الذي يتيح التعبير عكسها المستمر للبروتينات متحولة 30. باستخدام هذه الأدوات لتعديل الجينات (ق) في خلايا مختلفة 31 و المواقع 32،33 يستخدم لفهم كيفية السرطان بدء والتقدم وmetastasize 34. بدلا من الطفرات باستخدام نظام النوم الجمال ينقول هو تحديد برامج تشغيل جديدة من اتفاقية حقوق الطفل. التطوير المستمر من الفئران، وتقنيات واستراتيجيات التغيير الوراثية مستمرة في تطوير نماذج أكثر المرضى ذات الصلة.
م جديدةوقد وضعت ethods لتوصيف ظهائر المعوية وISCS. توصيف نسبة يمكن تحقيق ذلك باستخدام تدفق أنواع الخلايا الظهارية استنادا الخلوي على التعبير التفاضلية من كتين وCD24 35. يحتمل أن تكون وستبذل أكبر تقدم في علم الأحياء فهم ISC ودورها في مرض باستخدام المجراة سابقا عضي نظام الثقافة 36. هذا النظام يسمح ISCS العادية والخبيثة للثقافة في 3D، حيث تكرار والتفريق بطريقة أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية. ومن المؤمل أن هذه سيمكن الاختبار المباشر من المخدرات على عينات من المرضى في المختبر، مما يمهد الطريق للطب شخصية 37.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Mark Bishop, Mathew Zverev, Victoria Marsh-Durban, Adam Blackwood and Sylvie Robine. This work was funded by a programme grant from Cancer Research UK.
Materials
| Acetate buffer | * | * | To make 100ml: 4.8ml 0.2M Acetic acid, 45.2ml 0.2M Sodium acetate & 50ml distilled water |
| Acetic acid | Fisher Scientific | C/0400/PB17 | |
| Acetic anhydride | Sigma | A6404 | |
| Acetic anhydride solution | * | * | 2 M Acetic anhydride in 0.1 M triethanolamine hydrochloride |
| Alcian Blue | Sigma | A5268 | |
| Alcian Blue ph2.5 | * | * | To make 500ml: 15ml acetic acid, 5g Alcian Blue & 485ml distilled water |
| anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody | Abcam | ab119345 | |
| B(beta)-Naphthoflavone | Sigma | N3633 | BNF, inject without allowing the solution to cool too much as compound will drop out of solution. Solution can be re-used – store at -20°C between uses, do not reheat more than twice. |
| Bloxall | Vector Labs | SP-6000 | |
| BM purple | Roche | 11442074001 | |
| BSA | Sigma | A4503 | Bovine serum albumin |
| Chloroform | Fisher Scientific | C/4920/17 | |
| Citrate Buffer/Antigen Unmasking Solution | Vector Labs | H-3300 | |
| Corn oil | Sigma | C8627 | |
| Demucifiying solution | * | * | For 500ml: 50ml glycerol, 50ml Tris 0.1M pH8.8, 100ml EtOH, 300ml saline (0.9% NaCl in water), DTT 1.7g. Demucifying solution can be made in advance and stored, but DTT sholud be added just before incubation (340mg/100ml). |
| DEPC treated water | Life Technologies | 750023 | |
| DTT | Sigma | 101509944 | |
| EDTA | Sigma | O3690 | 0.5M |
| Ethanol | Fisher Scientific | E/0650DF/17 | |
| Filter paper | Whatman | 3000917 | |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| Formalin | Sigma | SLBL11382V | Neutral buffered formalin |
| Formamide | Sigma | F5786 | |
| Glutaraldehye | Sigma | G6257 | |
| H2O2 | Sigma | 216763 | |
| Haematoxylin | Raymond A Lamb | 12698616 | |
| HBSS | Gibco | 14175-053 | HBSS (-MgCl2+; -CaCl2) |
| Hybridisation buffer | * | * | 5× SSC, 50% formamide, 5% SDS, 1 mg/ml heparin, 1 mg/ml calf liver tRNA |
| Hydroquinone | Sigma | H9003 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase | Vector Labs | SK-4105 | |
| Immpress HRP Anti-Mouse IgG Kit | Vector Labs | MP-7402 | |
| Immpress HRP Anti-Rabbit IgG Kit | Vector Labs | MP-7401 | |
| Intestinal tissue powder | * | * | The small intestines of 5 adult mice were combined and homogenised in the minimum volume of ice cold PBS. 4 volumes of ice cold acetone were added to the homogenised intestine, which was mixed thoroughly and incubated on ice for 30 minutes. This was centrifuged and the pellet was washed using ice cold acetone. This was further centrifuged and the resulting pellet spread onto filter paper and allowed to dry. Once thoroughly dry the material was ground to a fine powder using a pestle and mortar. |
| K-ferricyanide | Sigma | P-3667 | |
| K-ferrocyanide | Sigma | P3289 | |
| Levamisole | Sigma | L0380000 | |
| Methacarn | * | * | 60% Methanol:30% Chloroform:10% Acetic acid |
| Methanol | Fisher Scientific | M/4000/17 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| Normal goat serum | Vector Labs | S-1012 | NGS |
| Normal rabbit serum | Dako | X0902 | NRS |
| NTMT | * | * | 100 mM NaCl, 100 mM Tris HCl, 50 mM MgCl2, 0.1% Tween20, 2 mM Levamisole |
| PAP pen | Vector | H-400 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| PBT | * | * | 0.5M NaCl, 10mM TrisHCL pH7.5, 0.1% Tween 20 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100x solutiuon. |
| Phosphate buffered saline (10x) | Fisher Scientific | BP3994 | Dilluted 1:10 with distilled water to make 1x |
| PLL slides | Sigma | P0425-72EA | Poly-L-lysine microscope slides |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Proteinase k solution | * | * | Dilute Proteinase K at 200 µg/ml in 50 mM Tris, 5 mM EDTA. |
| Ralwax | BDH | 36154 7N | |
| Reducer Solution | * | * | To make 100ml: 1g Hydroquinone, 5g sodium sulphite & 100ml distilled water |
| RnaseA | Sigma | R6148 | |
| Saline | * | * | 0.9% NaCl in distilled water |
| SDS | Sigma | I3771 | |
| Sheep serum | Sigma | S3772 | |
| Silver nitrate | Sigma | S/1240/46 | |
| Silver solution | * | * | To make 100ml: 10ml Acetate buffer, 87ml distilled water, 3ml 1% silver nitrate |
| Sodium acetate | Fisher Scientific | S/2120/53 | |
| Sodium Chloride | Sigma | S6753 | NaCl |
| Sodium sulfite | Sigma | 239321 | |
| SSC | Sigma | 93017 | 20x saline sodium citrate |
| Surgical tape | Fisher Scientific | 12960495 | |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | TAM, inject without allowing the solution to cool too much as compound will drop out of solution. Solution can be re-used – store at -20°C between uses, do not reheat more than twice. |
| TBS/T | Cell Signalling | #9997 | |
| Triethanolamine hydrochloride | Sigma | T1502 | |
| Tris-HCL | Invitrogen | 15567-027 | |
| Tween20 | Sigma | TP9416 | |
| VectaMount | Vector Labs | H-5000 | |
| VectaShield Hardset mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1500 | |
| Vectastain ABC Kit | Vector Labs | PK-4001 | |
| X-gal | Promega | V3941 | |
| X-gal fixative | * | * | 2% formaldehyde, 0.1% glutaraldehyde in 1xPBS |
| X-gal stain | * | * | X-gal stain; 200ul X-gal (A) in 50ml solution B (0.214g MgCl2, 0.48g K-ferricyanide, 0.734g K-ferrocyanide in 500ml PBS). Solution B can be made up oin advance and stored at 4°C |
| Xylene | Fisher Scientific | X/0200/21 |
Referências
- Cheng, H., Origin Leblond, C. P. differentiation and renewal of the four main epithelial cell types in the mouse small intestine. V. Unitarian Theory of the origin of the four epithelial cell types. Am J Anat. 141 (4), 537-561 (1974).
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
- Clevers, H. . The gut, a clonal conveyor belt. , (2015).
- Snippert, H., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
- Lopez-Garcia, C., Klein, A. M., Simons, B. D., Winton, D. J. Intestinal stem cell replacement follows a pattern of neutral drift. Science. 330 (6005), 822-825 (2010).
- Buczacki, S. J., et al. Intestinal label-retaining cells are secretory precursors expressing Lgr5. Nature. 495 (7439), 65-69 (2013).
- Basak, O., et al. Mapping early fate determination in Lgr5+ crypt stem cells using a novel Ki67-RFP allele. EMBO J. 33 (18), 2057-2068 (2014).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469 (7330), 415-418 (2011).
- Young, M., Ordonez, L., Clarke, A. R. What are the best routes to effectively model human colorectal cancer. Molecular oncology. 7 (2), 178-189 (2013).
- Sauer, B., Henderson, N. Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 85 (14), 5166-5170 (1988).
- Brault, V., et al. Inactivation of the beta-catenin gene by Wnt1-Cre-mediated deletion results in dramatic brain malformation and failure of craniofacial development. Development. 128 (8), 1253-1264 (2001).
- Fevr, T., Robine, S., Louvard, D., Huelsken, J. Wnt/β-catenin is essential for intestinal homeostasis and maintenance of intestinal stem cells. Molecular and Cellular Biology. 27 (21), 7551-7559 (2007).
- Ireland, H., et al. Inducible Cre-mediated control of gene expression in the murine gastrointestinal tract: effect of loss of beta-catenin. Gastroenterology. 126 (5), 1236-1246 (2004).
- Kemp, R., et al. Elimination of background recombination: somatic induction of Cre by combined transcriptional regulation and hormone binding affinity. Nucleic Acids Res. 32 (11), e92 (2004).
- Madison, B. B., et al. Cis elements of the villin gene control expression in restricted domains of the vertical (crypt) and horizontal (duodenum, cecum) axes of the intestine. J Biol Chem. 277 (36), 33275-33283 (2002).
- Parry, L., Young, M., El Marjou, F., Clarke, A. R. Evidence for a crucial role of paneth cells in mediating the intestinal response to injury. Stem Cells. 31 (4), 776-785 (2013).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21 (1), 70-71 (1999).
- el Marjou, F., et al. Tissue-specific and inducible Cre-mediated recombination in the gut epithelium. Genesis. 39 (3), 186-193 (2004).
- Guillemot, F., Nagy, A., Auerbach, A., Rossant, J., Joyner, A. L. Essential role of Mash-2 in extraembryonic development. Nature. 371 (6495), 333-336 (1994).
- Gregorieff, A., et al. Expression pattern of Wnt signaling components in the adult intestine. Gastroenterology. 129 (2), 626-638 (2005).
- van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).
- Merritt, A., Allen, T., Potten, C., Hickman, J. Apoptosis in small intestinal epithelial from p53-null mice: evidence for a delayed, p53-independent G2/M-associated cell death after gamma-irradiation. Oncogene. 14 (23), 2759-2766 (1997).
- Marshman, E., Ottewell, P., Potten, C., Watson, A. Caspase activation during spontaneous and radiation-induced apoptosis in the murine intestine. J Pathol. 195 (3), 285-292 (2001).
- Fevr, T., Robine, S., Louvard, D., Huelsken, J. Wnt/beta-catenin is essential for intestinal homeostasis and maintenance of intestinal stem cells. Mol Cell Biol. 27 (21), 7551-7559 (2007).
- Barker, N., et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).
- Tian, H., et al. A reserve stem cell population in small intestine renders Lgr5-positive cells dispensable. Nature. 478 (7368), 255-259 (2011).
- Yilmaz, O. H., et al. mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake. Nature. 486 (7404), 490-495 (2012).
- Adolph, T. E., et al. Paneth cells as a site of origin for intestinal inflammation. Nature. 503 (7475), 272-276 (2013).
- Marsh, V., et al. Epithelial Pten is dispensable for intestinal homeostasis but suppresses adenoma development and progression after Apc mutation. Nat Genet. 40 (12), 1436-1444 (2008).
- Jardé, T., et al. In vivo and in vitro models for the therapeutic targeting of Wnt signaling using a Tet-OΔN89β-catenin system. Oncogene. 32 (7), 883-893 (2013).
- Hung, K. E., et al. Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (4), 1565-1570 (2010).
- Dacquin, R., Starbuck, M., Schinke, T., Karsenty, G. Mouse alpha1(I)-collagen promoter is the best known promoter to drive efficient Cre recombinase expression in osteoblast. Dev Dyn. 224 (2), 245-251 (2002).
- Hinoi, T., et al. Mouse model of colonic adenoma-carcinoma progression based on somatic Apc inactivation. Cancer Res. 67 (20), 9721-9730 (2007).
- Sansom, O. J., et al. Loss of Apc allows phenotypic manifestation of the transforming properties of an endogenous K-ras oncogene in vivo. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (38), 14122-14127 (2006).
- Wong, V. W., et al. Lrig1 controls intestinal stem-cell homeostasis by negative regulation of ErbB signalling. Nat Cell Biol. 14 (4), 401-408 (2012).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- van de Wetering, M., et al. Prospective Derivation of a Living Organoid Biobank of Colorectal Cancer Patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
Citar este artigo
Parry, L., Young, M., El Marjou, F., Clarke, A. R. Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models. J. Vis. Exp. (105), e53429, doi:10.3791/53429 (2015).