Bakteri-konak Etkileşimleri karakterize etmek Biyomimetik Malzemeler

Polimer Beads Proteinlerin 1. Kimyasal Birleştirme Tiol-amin yönlü birleştirme Not: Bu protokol, proteinler Sülfosukinimidil 4- (p -maleimidophenyl) bütirat, çapraz bağlama maddesi olarak (Sülfo-SMPB) (Şekil 1) kullanılarak, polimer boncukları işlevselleştirilmiş amin içeren sistein bağlanması için uygundur. Şekil 1. Çapraz bağlama polimer taneleri proteinlerin yön tiyol-amin bağlanması için kullanılan stratejiyi. Amin modifiye polistiren boncuklar Sulfo-SMPB ile aktive edilir. Maleimid boncuk çift proteinleri yönlü ücretsiz sistein ile reaksiyona girer. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Reaktiflerin hazırlanması: PBS (100 mM sodyum fosfat, 150 mM NaCI, pH 7.0) ve otoklav hazırlayın. </li> Kullanımdan hemen önce bir 100x stok TCEP içinde (PBS içinde 0.5 M veya 287 mg / ml) (tris (2-karboksietil) fosfin) hazırlayın. 5x stok Sülfo-SMPB ve (dH 10 mM ya da 4.58 mg / ml 2 O) kullanımdan hemen önce hazırlayın. 10x stok (500 mM veya 88 mg / ml PBS içinde, pH 7.0) kullanımdan hemen önce sisteinin hazırlayın. Boncuk aktivasyon: Hafifçe ters çevirerek boncuk süspansiyonu karıştırın ve 1 ml steril PBS, pH 7.0 ihtiva eden bir steril 1.5 ml'lik bir tüp içine boncuk süspansiyonu (örneğin, 12 mi) gerekli miktarda aktarın. Yavaşça bir mikrosantrifüj (16.000 x g'de 2 dakika) santrifüj boncuk ve pelet yıkamak için aşağı yukarı pipet ve. Dikkatle bir pipet ve ıskarta ile süpernatant kaldırmak. Taze steril 1 ml PBS boncuk pelletini ve yıkama adımı tekrar edin. PBS 0,8 ml damla pelletini. , Taze hazırlanmış 10 mM Sulfo-SMPB 200 ml ekleyin nihai concent vermek2 mM oranı. Dönen bir tekerlek üzerinde 25 ° C'de 1 saat boyunca boncuk süspansiyonu inkübe edin. Protein azaltma: Aktivasyon aşaması kuluçka süresi boyunca, bu nedenle hemen aktif boncuklara ilave edilebilir, aşağıdaki birleştirme adımı için protein hazırlamak. Not: Bu indirgeme aşaması, her zaman GST (glutation-S-transferaz) füzyon proteinleri için gerekli değildir, ancak bu yüksek bağlanma özelliğine sağlamak için önerilir. Protein konsantrasyonu kontrol edin ve birleştirme reaksiyonu için gerekli olan son konsantrasyona göre ayarlayın. Not: PBS içinde 6 mM proteini ve 1 ml'lik bir hacim genellikle kullanılır. 5 mM'lik bir son konsantrasyon elde etmek TCEP stokları ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca çözelti inkübe edin. Not: Reaksiyon karışımı, doğrudan aşağıdaki birleştirme reaksiyonu için kullanılabilir. Pro belirlemek için, protein çözeltisine küçük bir miktar (bir kaç mi) koru tein konsantrasyon ve bağlanma verimliliği hesaplanması (bakınız bölüm 2). Protein birleştirme aşaması: Santrifüjlemeden sonra (2 dk, bir mikrosantrifüj 16.000 x g) aktive boncuklar Pelet ve taze, steril 1 ml PBS içinde bir kez pelet yıkayın. Istenilen protein konsantrasyonu verecek şekilde, hazırlanan protein solüsyonu (örneğin, 1 ml) içinde pelletini. Not: bağlanma adımı sırasında protein konsantrasyonu ortalama bağlanma verimliliğiyle (bağlanma etkinliği belirlenmesi için bakınız bölüm 2) ve (1.1.4.3 hesaplanan) istenen bağlanma yoğunluğuna bağlı olacaktır. Birleştirme adımı sırasında protein konsantrasyonu yaklaşık 6 mM olmalıdır, böylece etkinliği, yaklaşık% 85, 10x boncuk süspansiyonu, istenen nihai konsantrasyon 5 mM. Aşağıdaki formülü kullanarak bağlama yoğunluğu hesaplayın: jpg "/> Burada ρ c bağlama yoğunluğu [protein moleküllerinin sayısı / nm 2], Protein konsantre protein konsantrasyonu [mg / ml], Protein M protein molekül ağırlığı [Da] w boncuk boncuk kons konsantrasyonu [boncuk sayısı / L], d boncuk çapı [nm 2] Avogadro sayısı Ortalama ligand aralığı hesaplamak için birleştirme yoğunluğu kullanın: Dönen bir tekerlek üzerinde 25 ° C 'de 2 saat süre ile, protein-boncuk süspansiyonu inkübe edin. Not: Bazıproteinler, oda sıcaklığında stabil olmayabilir. Bu gibi durumlarda, reaksiyon 4 ° CO / N üzerinden gerçekleştirilebilir. 50 mM'lik nihai bir konsantrasyona kadar sistein stok ekleyerek boncuklar üzerinde kalan aktif gruplar devre dışı bırakın ve dönen bir tekerlek üzerinde 25 ° C'de 30 dakika boyunca bir süspansiyon inkübe edin. Santrifüj (2 dk, bir mikrosantrifüjde 16.000 xg) boncuk pelet. Protein konsantrasyonunu ve bir bağlanma verimliliğiyle hesaplanmasını belirlemek için süpernatan tutun (bakınız bölüm 2). Son ürünü vermek üzere, taze PBS, 1 ml 1 ml PBS ve tekrar süspansiyon ile iki kez kordon pelet yıkayın. Not: Yukarıdaki protokol, tipik olarak, daha sonraki deneyler (bakınız bölüm 3) için 10x stoklar olarak kullanılabilir 5 mM bir son protein konsantrasyonu, önceki, birleştirilmiş proteinin 1 ml verecektir. Protokol bölüm 3 devam etmek için, boncuk stoğu 100 ml / ml çalışma ya da 500 nM proteinin bir nihai yoğunlukta yürütüldüler. Not: Bu prosedüründe için iyi bir başlangıç ​​noktasıe 2 nm 3 x 10 -4 protein / ml'lik bir ortalama bağlanma yoğunluğu ya da 2 mm çapa sahip olan bir boncuk 57 nm'lik bir ortalama mesafe ile sonuçlanan, 2 x 10 12 boncuk / ml olacaktır. Tiol-karboksi yönlü birleştirme Not: Bu protokol, karboksil işlevselleştirilmiş polistiren boncuklara proteinler içeren sistein bağlanması için uygundur. Karboksil yarımı, ilk olarak, değiştirilmiş amin ve daha sonra çapraz bağlı Sülfo-SMPB (Şekil 2) ile 1-Etil-3- (3-dimetilaminopropil) karbodiimid (EDC) / N-hidroksisukinimid (NHS) kullanılarak aktive edilir. Şekil 2. Çapraz bağlama polimer boncuklara proteinler yönlü tiol, karboksil bağlanması için kullanılan stratejiyi. Karboksillenmiş polistiren taneleri, ilk EDC aktive edilen ve yarı-kararlı NHS-esteri oluşturmak için NHS ile modifiye edilir. Ethylenedi sonradan amin birleştirmeSülfo-SMPB ile reaksiyona giren bir serbest amin grubu, amin oluşur. Maleimid boncuklar sonra. Boncuk çift proteinleri yönlü ücretsiz sistein ile reaksiyona girebilen aktif bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Reaktiflerin hazırlanması: PBS (100 mM sodyum fosfat, 150 mM NaCI, pH 7.0) ve otoklav hazırlayın. Kullanımdan hemen önce TCEP içinde (PBS içinde 0.5 M veya 287 mg / ml), bir 100 x stok hazırlayın. 10x stok kullanımdan hemen önce EDC (PBS içinde 20 mM ya da 4 mg / ml) (1-Etil-3- (3-dimetilaminopropil) karbodiimid) hazırlayın. 10x stok NHS (PBS içinde 50 mM ya da 6 mg / ml) (N-hidroksisukkinimid) kullanımdan hemen önce hazırlayın. 5x stok Sülfo-SMPB ve (dH 10 mM ya da 4.58 mg / ml 2 O) kullanımdan hemen önce hazırlayın. Hemen b sistein 10x stok (500 mM veya 88 mg / ml'lik son yoğunluğa seyreltildi, pH 7.0) hazırlamakefore kullanımı. Boncuk aktivasyon: Hafifçe ters çevirerek boncuk süspansiyonu karıştırın ve 1 ml steril PBS, pH 7.0 ihtiva eden bir steril 1.5 ml'lik bir tüp içine boncuk süspansiyonu (örneğin, 12 mi) gerekli miktarda aktarın. Yavaşça bir mikrosantrifüj (16.000 x g'de 2 dakika) santrifüj boncuk ve pelet yıkamak için aşağı yukarı pipet ve. Dikkatle bir pipet ve ıskarta ile süpernatant kaldırmak. Taze steril 1 ml PBS boncuk pelletini ve yıkama adımı tekrar edin. PBS 0,8 ml damla pelletini. 10x EDC stokunun 100 ml (2 mM nihai konsantrasyon) ve boncuk süspansiyonuna 10x NHS stok çözeltisi (5 mM nihai konsantrasyon) hemen 100 ml ekleyin. Dönen bir tekerlek üzerinde 25 ° C'de 30 dakika boyunca boncuk süspansiyonu inkübe edin. 0,8 ml taze, steril PBS PBS ve tekrar süspansiyon 1 ml'lik bir kez boncuk yıkayın. 200 ml etilendiamin ekleyin ve incdönen bir tekerlek üzerinde 25 ° C'de 1 saat boyunca boncuk süspansiyonu Ubate. 1 ml PBS ile bir kez boncuk yıkayın ve taze PBS 0.8 ml içinde yeniden süspanse boncuklar. Bölüm 1.1.2.4 (Sulfo-SMPB ile boncuk aktivasyon) Bölüm 1.1.2 altında anlatılan itibaren devam ve bölüm 1.1 (Tiyol-amin yönlü kavrama) tarif protokol kalanını izleyin. Bölüm 1.1 de tarif edilenlere benzer bir şekilde proteinin hazırlanması ve protein bağlama işlemleri gerçekleştirin. Not: (. Yaklaşık% 75) Bu protokol kullanılarak, tipik bağlanma randımanı, bu nedenle, aynı birleştirme yoğunluğu elde etmek için uygun şekilde, ilk protein konsantrasyonunu ayarlamak bölüm 1.1 ile karşılaştırıldığında, biraz daha düşüktür. Kavrama Etkinliğinin Belirlenmesi 2. Not: aşağıda Bradford reaktifi 10 ve kolorimetrik tahlilleri, protein konsantrasyonu belirlemek kullanmak için: Yavaşça e Bradford Reaktifini ters reaktifin şekilde almalarının sağlanması homojenliği. Tampon maddesi içinde 0.1 ila 1.5 mg / ml BSA konsantrasyonları kapsayan protein standartlarının hazırlanması, 10 mg / ml BSA stok solüsyonu kullanılması. Bir 96-kuyulu plakanın kuyularına Bradford reaktifi 250 ml ekleyin. Tüm örneklerde, Protein standartlarının ve negatif kontroller (sadece tampon) için yeterli kuyu hazırlayın. 96-çukurlu plaka içinde reaktifi (negatif kontrol için Protein standartlarının veya tamponu), protein örneğinin 5 ml ekleyin. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında orbital bir karıştırıcı üzerinde plaka inkübe edin. Bir plaka okuyucusu kullanılarak 595 nm'de absorbansı ölçülür. A595 nm'ye karşı BSA konsantrasyonu standart bir eğri oluşturmak ve ilk ve süpernatan numuneler içindeki protein yoğunluklarının belirlenmesi için kullanabilir. Şöyle bağlanmış protein konsantrasyonu hesaplanır: Bağlanma verimliliğini olarak hesaplayın: 00eq4.jpg "/> Rekabet tahlilleri Boncuk-bağlanmış adezinlerin 3. Hazırlık: Tohum, 24 oyuklu bir plakaya 150,000 hücre / ml 'lik bir konsantrasyonda bir rekabet deneyinde bir gün önce de Hela hücreleri, oyuk başına 1 mi, hücreler önce, deney başlamadan yaklaşık% 80 birleşik duruma ulaştılar izin vermek. Üçlü olarak her deneysel koşul ayarlayın. Negatif kontroller için kuyular (rekabet deneyleri sırasında eklenen hiçbir bakteri), pozitif kontroller ve (sitotoksisite deneyleri için) lizis kontrolleri (sadece yarışma deneyleri sırasında eklenen füzyon etiketi bağlanmış kontrol boncuk) ekleyin. V. taze bir kolonisi olan 5 ml deniz LB (MLB) kültür aşılamak parahaemolyticus ve sallayarak, 30 ° C'de O / N büyür. Bölüm 1. (Kuplaj) 'de tarif edildiği gibi, yeterli bir kordon ile birleştirilmiş MY hazırlayın. 10x boncuk stoğu 100 ml Veren ile sabitleştirilir. Rekabet deneyi: Competit günündeiyon deneyi, bakteri kültürü OD 600 ölçün. Katkı maddesi olmadan, renksiz bir DMEM içinde bakteri kültürleri seyreltilmesi ile enfeksiyon ortamı hazırlanır,% 10 v / v boncuk süspansiyonu (her iki adezin-bağlanmış taneleri veya kontrol tanesi), 10 MOl'de 1 ml hazırlayın vermek üzere ihtiva eden 37 ° C önceden ısıtılmış / oyuk ve örnek başına 10-20% -fazla hacmi. Not: Yukarıda belirtilen koşullar altında (24 oyuklu plaka, V. parahaemolyticus, 10 İB), O / N kültürü gerekli hacim için kültür 3 / OD 600 olarak hesaplanır oyuk (ml / ml) başına eklenmelidir. Örneğin, enfeksiyon ortamı, 1 ml tipik haliyle, bakteri kültürü, birkaç ml 100 mi boncuk süspansiyonu içerecek ve renksizdir, katkısız DMEM 1 ml'ye kadar yapılır. Kuyulardan eski orta çıkarın ve her bir 37 ° C, steril PBS önceden ısıtılmış 1 ml ekleyerek kültürlenmiş Hela hücreleri yıkayın. PBS çıkarın ve oyuk başına enfeksiyon ortamı 1 ml. Ayrıca çözümler cont ekleyerek, kontrolleri kurmak% 0.1 Triton X-100 (sitotoksisite ölçümleri için, sadece gerekli liziz kontrol) içeren kontrol boncuklar ve bakteriler (pozitif kontrol) ya da adezin boncuk ve hiçbir bakteri (negatif kontroller) veya DMEM Tahliye. Istenen süre (örneğin, sitotoksisite ölçümleri için 4 saat ya da yapışma ölçümleri için 1 saat) 37 ° C 'de, bir doku kültürü inkübatörü içinde, plaka inkübe edin. Not: konakçı hücreler bakteriyel yapışma ve sitotoksisite Hem inhibisyon etkinliği için okuma-çıkışları olarak kullanılabilir. Sitotoksiklik ve yapışma ölçümlerinin zaman noktaları uyuşuyorlarsa sitotoksisite kültür süpernatanı ve bağlanma tahlilleri, kalan hücre katmanı elde edilen numuneleri kullanmak kullanılarak tespit edilir, çünkü her iki çalışma, aynı kaynaktan örnekler kullanılarak gerçekleştirilebilir. Sitotoksisite ölçümleri: Belirtilen zaman noktalarında (örn 4 saat sonrası enfeksiyon), her 24 kuyu ve transfer için üç kez 200 ml kaldırmakBir 96-yuvalı plaka. De yeni bir 96 oyuklu bir plakaya, 1500 x g'de, her 5 dakika ve transfer 100 ml, 96 gözlü levhalar dönerler. Üç kopya halinde 96 oyuklu bir plakanın oyuklarına taze enfeksiyon deneyleri sırasında kullanılan ortamın 100 ml (bu boş olarak kullanılacaktır) ekleyin. Laktat dehidrogenaz (LDH) salım deneyi bir LDH sitotoksisite belirleme kiti kullanılarak ve üreticinin yönergeleri izleyerek gerçekleştirin. Kısaca, 25 artışlarla ihtiyaç duyulan reaktif miktarını hesaplamak (62 numune ölçülecek ise, örneğin, 75 vs. için yeterli reaktif karışımı makyaj). Örneğin, 100 numune için, reaktif B Invert 250 ul reaktif A 11,25 ml karışımı, köpük önlemek için girdap yok. Çok kanallı bir pipet ile pipetleme edebilmek için bir hazne karışımı koyun. Her bir örnek için reaktifi karışımı 100 ul ekle. Oda sıcaklığında inkübe ve plaka 10, 20, 30 dakika sonra, bir plaka okuyucusu üzerinde 490 nm'de absorbans okunur. </li> Liziz kontrol numunesinin absorpsiyonunu yüksek ama yine plaka okuyucu (tipik haliyle, 2-3 absorbans birimi) lineer aralığında olduğu veri kümesi analiz edin. Dönüşüm için aşağıdaki formül kullanılarak,% sitotoksisite gibi sonuçları Express: Bakteriyel yapışma ölçümü: Belirtilen zaman noktalarında (örn 1 saat sonrası enfeksiyon) olarak, hücre tabakasından ortamı çıkarın. İyice herhangi bir un bağlı hücreleri çıkarmak için, steril, önceden ısıtılmış PBS (1 ml PBS her birinin en az 3-4 yıkama) hücre tabakası yıkayın. PBS içinde Triton X-100 çözeltisi h steril% 1 v 1 ml / eklenerek göz başına Lyse konakçı hücreler sunar. 5 dakika boyunca 37 ° C 'de plaka inkübe edin. 1.5 ml tüpler ayırmak için de her içeriğini aktarmadan önce her bir örnek yukarı ve aşağı birkaç kez pipetle. Örneklerin 10 kat seri dilüsyonları hazırlayınsteril PBS içine (örneğin, numune 100 ml PBS 900 ml kullanım). Levha 100 MLB agarı üzerinde her bir numunenin mi ve bir hücre dağıtıcı kullanılarak yayıldı. Bakteri suşları ve zaman noktasına bağlı olarak plaka sulandırmalarda hangi optimize edin. Not: Açıklanan deney düzeneği için, 10 5 ya da 10 6 kat seyreltme CFU sayısını uygun bir sayı verir. 37 ° CO / N plakaları inkübe ve koloni sayımı ile bakteri numaralandırma.