المواد الجزيئية الحيوية لوصف التفاعلات البكتيريا في استضافة
Summary
Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.
Abstract
Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting “bacteriomimetic” materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial – host interactions.
Introduction
Dissecting the interactions between bacterial adhesins and host surface receptors at the host-pathogen interface is an essential step towards our understanding of the underlying mechanisms driving bacterial adhesion. Ultimately, this will help us to identify strategies to interfere with these processes during infections. In conducting such studies, we often face a dilemma: Biochemical and biophysical analysis of the molecular mechanisms of adhesin binding requires their separation from other cell wall components, which may interfere with adhesion events. On the other hand, the use of recombinant soluble proteins over-simplifies the adhesion event, by disregarding protein anchoring in the bacterial cell wall and multivalency of binding achieved through bacterial surface display. Equally, from the host cell’s perspective, encountering and binding to single adhesin molecules does not always have the same impact in terms of plasma membrane organization, membrane fluidity and receptor clustering1 and this, ultimately, makes it difficult to evaluate the impact of adhesion on host cellular signaling and the outcome of bacteria-host interactions.
Recently a method was devised, whereby recombinant purified adhesins or adhesin fragments are directionally and covalently coupled to polymer particles similar in size to bacteria, thus mimicking bacterial surface display. This approach has been used on a range of different adhesins, from Gram-negative Multivalent Adhesion Molecules (MAMs)2, 3, to Gram-positive adhesins including Staphylococcus aureus fibronectin binding protein (FnBPA)4, 5 and Streptococcus pyogenes F1 6, 7. This method has allowed the dissection of adhesin fragments important for host cell binding, identification of host surface receptors and determination of their behavior on the host cell surface, while taking both binding affinity and avidity into consideration 1, 8. Additionally, this approach has been used to investigate the efficacy of immobilized adhesins and derivatives as inhibitors of host-pathogen interactions 8, 9. It has been demonstrated that surface coupled derivatives of the Vibrio parahaemolyticus Multivalent Adhesion Molecule (MAM) 7 can be used to attenuate a range of bacterial infections in vitro, including those caused by multidrug-resistant pathogens such as Acinetobacter baumannii and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) 7, 9.
Herein, we describe different chemistries which can be used to immobilize adhesins to commercially available functionalized polystyrene particles. Due to the wide array of available surface functionalities, labels and particle sizes, these are a useful scaffold for the production of bacteriomimetic materials to investigate adhesin-host interactions. We further describe methods for the initial characterization of the coupling reaction, and for the calculation of important properties of the resulting materials. Finally, the use of bead-coupled adhesins as competitive inhibitors of in vitro bacterial infections is discussed as an example of their application, as well as the future scope and limitations of this approach.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، وصفنا بروتوكولين، والتي يمكن استخدامها للبروتينات التي تحتوي على ثيول زوجين لamine- او الخرز البوليسترين المعدلة الكربوكسيل، على التوالي. نظرا لسهولة هذا الإجراء، ثيول-أمين اقتران هو الأفضل، ولكن اعتمادا على مواصفات حبة المطلوب (قطر، خصائص مضان)، واستخدام الخرز functionalized أمين قد لا يكون ممكنا وقمنا بالتالي تضمن البروتوكول الذي سيتم تحويل الكربوكسيل – إلى شاردة أمين لإعطاء الباحث أكبر قدر ممكن من المرونة في اختيار سقالة. على الرغم من أن كلا ثيول-أمين وثيول-الكربوكسيل عمل اقتران لأي السيستين التي تحتوي على البروتين، واقتران الاتجاه (أي الشلل في البروتين لكل من N-محطة، ومحاكاة سطح الشاشة) يتطلب البروتين دون بقايا السيستين، التي يتم إنتاجها كما الانصهار GST البروتين، أو التي تحتوي على واحدة محطة بقايا السيستين الذي عرضته موقع الموجهة الطفرات. إذا ما تم احتواء متعددة cysteines رد الفعلداخل البروتين، وهذا سوف يؤدي إلى الشلل العشوائي الذي قد يعرقل وظيفة البروتين. العديد من adhesins البكتيرية لا تحتوي على cysteines بشكل طبيعي. بالنسبة للآخرين، وهذه قد يمكن إزالتها عن طريق موقع موجه الطفرات، على الرغم من أن ذلك يتطلب فحوصات مكثفة لضمان الاحتفاظ بنية الأصلي وظيفة في متحولة. لGST البروتينات الانصهار، والنقاء GST-العلامة جانب لحبات يمكن أن تستخدم لمراقبة سلبية مناسبة. باستخدام الخرز وفكت كعنصر تحكم ينبغي تجنبها، وهذه غالبا ما يكون الميل العالي لتتجمع معا أو الانضمام إلى خلايا غير وجه التحديد. نسخة مبسطة من بروتوكول 1.2، فقط باستخدام EDC، ويمكن استخدامها للبروتينات الزوجين الخرز البوليمر functionalized الكربوكسيل، ولكن في هذه الحالة اقتران تتم عن طريق الأمينات الأولية في البروتين، وبالتالي لا يضمن اقتران الاتجاه.
TCEP كعامل مختزل يجب عدم استبدال غيرها من عوامل خفض المتاحة تجاريا والتي يشيع استخدامها، مثل dithiothreitol (DTT) أو 2-المركابتويثانول (BME)، كما التجولات الواردة في داخلها سوف تتنافس مع البروتين اقتران في خطوة اقتران ثيول maleimide. PBS يمكن استبدال مع مخازن أخرى، ولكن مع الاعتبارات التالية: قد لا يحتوي على المخازن الأمينات الأولية (حتى مخازن تريس التي تحتوي على ليست مناسبة). استخدام المخازن التي تحتوي على (<10MM) تركيزات منخفضة جدا الملح يؤدي إلى تراكمها وحبة كما ينبغي تجنبها. نقاء البروتين هو أيضا عامل مهم للنظر خلال هذا الإجراء، والحصول على بيانات ذات جودة عالية، وينبغي أن تستخدم بروتينات نقية. نحن بشكل روتيني تنقية البروتينات في خطوات متعددة، بما في ذلك على الأقل خطوة تنقية تقارب والترشيح هلام، ولكن يحدث في بعض الحالات التبادل الأيوني اللوني كخطوة ثالثة. ونتيجة لذلك نقاء البروتينات المستخدمة لاقتران هو عادة 90٪ أو أعلى، كما تقرره SDS-PAGE.
فمن المستحسن لتحديد تركيزات البروتين سواء في خليط التفاعل الأولي وكذلك من الالبريد طاف بعد الانتهاء رد فعل. هذا سوف يساعد على تحديد تركيز واضح من البروتين بالإضافة حبة، وبالتالي كثافة اقتران. وتحديد كل من القيم أيضا تسمح حساب كفاءة اقتران. يمكن أن يؤخذ هذا في الاعتبار عند إعداد الحل البروتين الأولي في التفاعلات اللاحقة، لتحقيق التركيز واقتران النهائية الكثافة المطلوبة. هي مناسبة برادفورد كاشف ولا سيما لتحديد تركيز البروتين قبل وبعد رد فعل اقتران، لأن أيا من المواد في رد فعل يتداخل مع تشكيل الصبغة المعقدة في التراكيز المستخدمة. إذا تركيزات البروتين أقل لاستخدامه، قد يكون هذا الأسلوب لتحل محلها طريقة الكشف أكثر حساسية، ولكن الاهتمام يجب أن يدفع ذلك إلى حقيقة أن لديها لتكون متوافقة مع المواد الواردة في رد فعل اقتران. ويوصى أيضا إلى استخدام الطازجة الكواشف والتعامل مع المواد الكيميائية مسحوق مع الرعاية (على سبيل المثال، مخزن في حاوية مغلقة واستخدام الخرز السيليكا، لتجنب الكواشف رسم الرطوبة) منذ نوعية الكواشف سوف تؤثر على كفاءة اقتران. اذا كانت كفاءة اقتران أقل مما كان متوقعا، والعلاجات المحتملة تشمل زيادة تركيزات حبة والبروتين الأولية. إذا كان يتم استخدام تركيزات أعلى، وتركيز الكواشف اقتران لابد من زيادة نسبيا لضمان زيادة المولي كافية. تعديل تركيزات حبة / البروتين وعادة ما يكون خطوة أفضل نحو التحسين بدلا من زيادة أوقات رد الفعل. منذ بروتوكولات للحبة اقتران تستغرق وقتا طويلا، ونحن عادة إعداد دفعة كبيرة من المواد. aliquots من تعليق يمكن تجميد المفاجئة في النيتروجين السائل وتخزينه في -20 درجة مئوية لعدة أشهر. لا ينبغي أن refrozen قسامات إذابة ويجب أن تبقى في 4 درجات مئوية وتستخدم في غضون 1-2 أيام. ومع ذلك، فإن هذا سوف تختلف مع طبيعة واستقرار بروتين يستخدم كما يجب اختبارها على دفعة صغيرة في البداية.
<p clasالصورة = "jove_content"> adhesins حبة الديناميكي يمكن استخدامها في العديد من التطبيقات، كما هو مبين أدناه. ووصف هذا البروتوكول مقايسة يستخدم عادة لقياس تثبيط للخلايا ملزمة وبوساطة العوامل المسببة للأمراض البكتيرية في الخلايا المضيفة. يتم إجراء الفحص عادة لقياس قدرة MAMs يقترن حبة لمنع تنافسية إصابة الخلايا الظهارية هيلا مع البحر التي تنقلها الأغذية الممرض الضمة نظيرة الحالة للدم، وذلك باستخدام إما انخفاضا في التصاق البكتيريا الى الخلايا المضيفة أو تخفيض السمية الخلوية كما للقراءة خارج . في كلتا الحالتين، وإعداد المقايسات والمنافسة تتبع نفس البروتوكول. اعتمادا على قراءات، سلالات مختلفة من V. تستخدم نظيرة الحالة للدم: سلالة السامة للخلايا يستخدم POR1 لقياس السمية الخلوية، في حين تم استخدام نوع غير السامة للخلايا POR2 لقياس التصاق البكتيريا، منذ موت الخلايا والخلايا المفرزة يهدد الإجراء لقياس البكتيريا المرفقة.في البداية، تعوضأقيمت التجارب tition لتكون بمثابة خطوة حكيمة بروتوكول، حيث كانت الخلايا المضيفة الأولى المحتضنة مسبقا مع حبات قبل إضافة البكتيريا. لV. نظيرة الحالة للدم والمواصفات حبة المستخدمة (2 ميكرومتر الخرز بالإضافة إلى MAM7)، وكلاهما الخرز والبكتيريا ويمكن أن يضاف في نفس الوقت دون تغييرات في السمية الخلوية الناتجة عن ذلك. بمعنى آخر، في هذا الإعداد التجريبية، والخرز تكومبيتي البكتيريا عن الخلية المضيفة ملزمة. اعتمادا على هندسة الأنواع البكتيرية وحبة المستخدمة، قد تكون هناك أسباب وجيهة للحفاظ على التصاق حبة والعدوى البكتيرية كما خطوتين منفصلتين. على سبيل المثال، لتصيب الخلايا مع البكتيريا غير متحركة، لوحات وطرد عادة بعد إضافة وسائل الإعلام العدوى. ومع ذلك، ينبغي تجنب الطرد المركزي لوحات تحتوي على تعليق حبة، لأن هذا يؤدي إلى التوزيع غير المتكافئ للغاية من الخرز على طبقة الخلايا. إذا كان يتم استخدام أحجام الجسيمات الصغيرة، والخرز يستغرق وقتا أطول لتسوية على سطح الخلية، وفي هذه الحالة سووينبغي أن يسمح الوقت fficient لمرفق حبة مسبق للعدوى. عند استخدام التصاق البكتيريا باعتباره تلا، يجب أخذ العينات في نقاط زمنية حيث لا تلف الخلايا المضيفة بشكل كبير من سلالة تصيب، وانفصال الخلايا وتحلل ويمكن أن تمس الكمي من البكتيريا المرفقة.
بدلا من تعداد التصاق البكتيريا بواسطة الطلاء التخفيف، قد بدلا من معالجتها عينات للتصوير (الشكل 5). في هذه الحالة، يجب أن المصنف الخلايا زراعة الأنسجة على زلات غطاء زجاجي، وليس مباشرة في الآبار. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام الخرز والبكتيريا الفلورسنت معربا عن بروتين فلوري، جنبا إلى جنب مع علامات الخلية المضيفة عدوى محددة. على سبيل المثال، يتم تصوير التجارب المنافسة عادة باستخدام أحمر فلوري رودامين-phalloidin وصمة عار على الخلايا المضيفة الأكتين الهيكل الخلوي وتقييم التغيرات المورفولوجية الناتجة عن العدوى، جنبا إلى جنب مع الخرز الأزرق الفلورسنت والفلورسنتالأخضر (GFP التعبير عن أو SYTO18 الملون) البكتيريا.
وهناك مجموعة من adhesins يقترن حبة، بما في ذلك المكورات العنقودية الذهبية FnBPA، العقدية المقيحة F1 FUD والضمة نظيرة الحالة للدم MAM، وقد استخدمت كمواد المحاكاة البيولوجية لدراسة التصاق، التصاق تثبيط ومساهمة الانضمام إلى بوساطة الممرض سمية الخلايا 1 و 7 و 8. واحدة من مزايا استخدام هذا النهج هو سهولة التصور الأحداث المرفق، منذ الخرز البوليمر استخدام السقالات متوفرة في مجموعة واسعة من الألوان (على سبيل المثال، أزرق، أحمر فلوري والأزرق والأخضر والبرتقالي). وهكذا، ووضع العلامات البروتين المباشر، والتي قد تتداخل مع وظيفة، يمكن تجنبها. بالإضافة إلى ذلك، سطح يقلد اقتران العرض متعددي من adhesins على سطح البكتيرية، مما يعكس التشكل أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية بالمقارنة مع بروتينات قابلة للذوبان.
بالمقارنة مع الدراسات التي تستخدم البكتيريا سليمة أو البكترياالمسوخ القاعدة ونهج حبة تلتف المشاكل المرتبطة نمو البكتيريا. على سبيل المثال، وعلى المدى الطويل (على سبيل المثال، O / N) غالبا ما يثير الشبهة دراسات التصاق البكتيريا إلى الخلايا باستخدام البكتيريا سليمة استضافة الظواهر المصاحبة نمو البكتيريا – تحمض استنزاف متوسطة النمو والمغذيات تؤثر سلبا على الخلايا المضيفة، وتكرار البكتيرية يضر في نهاية المطاف جودة التصوير.
وفي الآونة الأخيرة، وقد تم تمديد استخدام adhesins يقترن حبة لتشمل استخدامهم كأدوات للالتنقيات تقارب من المضيف الخلوية العوامل التي تدخل في عمليات المصب من التصاق البكتيريا الإشارة. V. نظيرة الحالة للدم MAM7، عن طريق ملزمة لالأحماض الفسفاتيديك في غشاء الخلية المضيفة، وموجبات تفعيل RhoA والأكتين إعادة ترتيب 1 و 3. ويجري استخدام الخرز يقترن MAM لتنقية وتحديد البروتينات المشاركة في منصات الإشارات تجميعها نتيجة لخلية MAM-المضيفة ربط. منذ الخرز يمكنبسهولة يمكن فصلها من طاف بواسطة خطوة الطرد المركزي قصيرة، ويقترن البروتين من الفائدة تساهميا، وهذا هو وسيلة جيدة لتحقيق الانفصال عن البروتينات الملوثة وإثراء مجمعات البروتين ذات الصلة، والتي يمكن استخدامها لتطبيقات المصب مثل البروتينات أو ويسترن النشاف.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank members of the Krachler group for critical reading of the manuscript. DHS, DV and AMK were funded by the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/L007916/1), FA was funded by a Republic of Iraq Ministry of Higher Education and Scientific Research Scholarship and NPS was funded by a CONICYT Scholarship.
Materials
| Reagents | |||
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma | 646547 | Danger; corrosive can be bought as solution or freshly prepared |
| Sulfosuccinimidyl 4-(p-maleimidophenyl)butyrate (Sulfo-SMPB) | Fisher | PN22317 | Danger; toxic |
| L-cysteine | Sigma | 30089 | Danger; toxic |
| Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent blue – aqueous suspension, 2.0 μm mean particle size | Sigma | L0280 | harmful; a range of alternative particle sizes and colors is available |
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) | Thermo scientific | 22980 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Thermo scientific | 24500 | |
| Carboxylate-modified polystyrene beads | Sigma | CLB9 | harmful; a range of alternative particle sizes and colors is available |
| Ethylenediamine | Sigma | E26266 | Danger; flammable, corrosive, toxic, sensitizing |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Promega | W3841 | |
| Bradford reagent | Sigma | B6916 | Danger; corrosive and toxic |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose – With 4500 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine, sodium pyruvate, and phenol red, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D1145 | for infection experiments |
| DMEM | Sigma | D6429 | for maintenance of cultured host cells |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Sigma | F9665 | supplement for tissue culture medium |
| Penicillin-Streptomycin – Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
Sigma | F9665 | supplement for tissue culture medium |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| LDH Cytotoxicity detection kit | Takara | MK401 | |
| Plasticware | |||
| reagent reservoirs (25ml) | SLS | F267660 | |
| 24-well plates | Greiner | 662160 | |
| 96-well plates | Greiner | 655182 | |
| Equipment | |||
| haemocytometer | |||
| microcentrifuge | |||
| plate reader | |||
| tissue culture facilities | |||
| multichannel pipette |
Referências
- Lim, J., Stones, D. H., Hawley, C. A., Watson, C. A., Krachler, A. M. Multivalent Adhesion Molecule 7 clusters act as signaling platform for host cellular GTPase activation and facilitate epithelial barrier dysfunction. PLoS Pathog. 10 (9), e1004421 (2014).
- Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. Outer membrane adhesion factor multivalent adhesion molecule 7 initiates host cell binding during infection by gram-negative pathogens. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (28), 11614-11619 (2011).
- Krachler, A. M., Orth, K. Functional characterization of the interaction between bacterial adhesin multivalent adhesion molecule 7 (MAM7) protein and its host cell ligands. J Biol Chem. 286 (45), 38939-38947 (2011).
- Joh, D., Speziale, P., Gurusiddappa, S., Manor, J., Hook, M. Multiple specificities of the staphylococcal and streptococcal fibronectin-binding microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules. Eur J Biochem. 258 (2), 897-905 (1998).
- Bingham, R. J., et al. Crystal structures of fibronectin-binding sites from Staphylococcus aureus FnBPA in complex with fibronectin domains. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105 (34), 12254-12258 (2008).
- Ensenberger, M. G., et al. Specific interactions between F1 adhesin of Streptococcus pyogenes and N-terminal modules of fibronectin. J Biol Chem. 276 (38), 35606-35613 (2001).
- Hawley, C. A., Watson, C. A., Orth, K., Krachler, A. M. A MAM7 peptide-based inhibitor of Staphylococcus aureus adhesion does not interfere with in vitro host cell function. PLoS One. 8 (11), e81216 (2013).
- Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. Turnabout is fair play: use of the bacterial Multivalent Adhesion Molecule 7 as an antimicrobial agent. Virulence. 3 (1), 68-71 (2012).
- Krachler, A. M., Mende, K., Murray, C., Orth, K. In vitro characterization of multivalent adhesion molecule 7-based inhibition of multidrug-resistant bacteria isolated from wounded military personnel. Virulence. 3 (4), 389-399 (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
