Summary

Haute résolution La quantification du comportement Odor-guidée dans<em> Drosophila melanogaster</em> Utilisation de la<em> Flywalk</em> Paradigm

Published: December 11, 2015
doi:

Summary

Le Flywalk système de suivi automatisé est utilisé pour la haute résolution de quantification comportement d'odeur guidé dans Drosophila melanogaster.

Abstract

Dans leur milieu naturel, les insectes comme la mouche du vinaigre Drosophila melanogaster sont bombardés avec une énorme quantité de substances odorantes chimiquement distinctes. Pour compliquer encore les choses, les odeurs détectées par le système nerveux des insectes sont généralement pas de composés simples, mais les mélanges dont la composition et les ratios de concentration varier. Ceci conduit à une quantité presque infinie de différents stimuli olfactifs qui doivent être évaluées par le système nerveux.

Pour comprendre quels aspects d'une relance de l'odeur de déterminer son évaluation par la mouche, il est donc souhaitable d'examiner efficacement le comportement des odeurs guidé vers de nombreuses substances odorantes et mélanges d'odeurs. Pour corréler directement le comportement de l'activité neuronale, le comportement doit être quantifiée dans un délai comparable et dans des conditions identiques à celles de relance dans des expériences neurophysiologiques. Cependant, de nombreux essais biologiques olfactifs actuellement utilisés chez la drosophile neuroéthologie sont plutôt spécialisée soit vers l'efficacité ou vers la résolution.

Flywalk, un système de livraison de l'odeur et de suivi automatisé, comble le fossé entre l'efficacité et de la résolution. Il permet de déterminer exactement quand un paquet d'odeur stimulé une mouche marchant librement, et de déterminer les animal's réaction comportementale dynamique.

Introduction

L'objectif primordial de toute recherche neuroethological est d'établir un lien de causalité entre les états d'activité de neurones individuels ou circuits neuronaux et le comportement d'un organisme. Pour atteindre cet objectif de l'activité neuronale et le comportement doit être surveillée dans des conditions identiques de relance et ces conditions de relance devrait idéalement être similaires à ceux du système nerveux sous surveillance évolué pour donner un sens. Particulièrement quand il vient à des essais biologiques du comportement, ces exigences ont historiquement prouvé très exigeant dans Drosophila melanogaster neuroéthologie olfactif.

Une fois libéré de la source, des panaches d'odeur éclatent rapidement, en filaments minces avec la diffusion turbulente causé par le mouvement de l'air étant le principal déterminant de la distribution d'odeur 1. En conséquence, un insecte naviguer vers une source d'odeur subit une stimulation intermittente avec des paquets d'odeurs avec des intervalles variables entrecoupées d'air propre. Les deuxla marche et les insectes volants – y compris la drosophile – ont été démontrés à exploiter ce régime de stimulation intermittente pour la navigation par vent sur ​​la flambée rencontre panache et principalement déplaçant vent de travers en l'absence d'odeurs 2 – 5. Considérant que les procédures de stimulation dans des expériences physiologiques imiter largement celles d'un insecte peut vivre dans son environnement naturel, soit en fournissant bouffées simples d'odeurs entrecoupées de longues périodes de l'air ou des séquences de stimulation dynamiques 6 – 11, de nombreux essais biologiques comportementaux utilisés dans Drosophila neuroéthologie tels que dosage de piège , arènes en plein champ ou T-labyrinthe reposent sur ​​odeur gradients 12 – 15. Toutefois, en raison des gradients odeurs, par définition, sont variables en fonction de la concentration distance de la source des odeurs, un comportement particulier peut pas être attribuée à une concentration d'odeur précis en utilisant ces paradigmes. En outre, la pente deun gradient d'odeur dépend de façon critique sur les propriétés physico-chimiques de la substance odorante. Un gradient d'un composé très volatil sera moins profonde que celle créée par un composé moins volatile et donc plus difficiles à suivre pour un organisme comptant sur ​​la mesure des différences de concentration dans l'espace comme les seuls moyens de navigation 16 – 20, ce qui peut conduire à une mauvaise interprétation des préférences olfactives notamment dans des essais de choix. Cet effet est également très préjudiciable lors d'enquêtes sur les comportements vers des mélanges d'odeurs car elle conduit à différents rapports de composants de mélange à chaque point de l'espace et donc à nouveau interdit à une corrélation claire entre la physiologie et le comportement.

Alors que des mouches du vinaigre ont tendance à se rassembler dans la fermentation de fruits, ils sont solitaires dans leur navigation vers les sources de nourriture et des sites de ponte. Néanmoins, plutôt que de tester les animaux individuels de nombreux paradigmes comportementaux utilisés chez la drosophile neuroetholoGY examiner le comportement de l'odeur-guidée de cohortes de mouches et de l'attraction est marqué comme la fraction de mouches qui choisissent l'odeur sur une relance de contrôle. Ces expériences de cohorte ont grandement contribué à la compréhension de la mouche neuroéthologie et la plupart des observations faites par leur utilisation pourrait être confirmé dans des expériences unique mouche. Cependant, il a été observé que les mouches peuvent influencer chaque décision other's 21 et dans les cas extrêmes, l'évaluation d'une odeur peut passer de l'indifférence à l'évitement selon la densité de la population 22. En outre, les résultats de ces types d'expériences fournissent souvent uniquement le point de terminaison d'une séquence de décisions comportementales plutôt que d'observer ce qui fait à la volée tout en elle le fait, ce qui serait souhaitable lorsque l'on tente de mettre en corrélation avec le comportement de l'activité neuronale. Ces expériences de cohorte plutôt faible résolution sont contrastés par haute résolution méthodes seule mouche comme les arénas de vol captif et tapis roulants qui permettentpour une observation directe des réponses comportementales au moment où le stimulus est présenté 20,23,24. Néanmoins, les expériences de la cohorte sont toujours populaires, car ils sont très efficaces et fournissent des résultats robustes, même à comparable tailles bas-échantillons, car la variabilité inter-individuelle et inter-procès sont partiellement en moyenne en raison de l'observation de populations sur des périodes de temps prolongées. Bien vol captif et tapis roulant offrent probablement la norme d'or concernant la présentation du stimulus et résolution temporelle, les arènes utilisés sont conçus pour les animaux simples et il est donc temps pour obtenir des tailles d'échantillon nécessaire pour une analyse statistique. Plusieurs autres approches ont été récemment mis au point qui permettent une acquisition efficace des données comportementales à haute résolution en combinaison avec un régime de relance bien défini. Ceux-ci comprennent sans surveillance suivi 3D de plusieurs mouches du vinaigre dans une soufflerie en combinaison avec un modèle 3D précise de l'odeur panache 5 </sup>, suivi de plusieurs mouches individuels dans les chambres de choix fournis avec les courants d'air des deux côtés 25 et le paradigme Flywalk 26.

Dans Flywalk, 15 mouches individuelles sont situées dans de petits tubes de verre et surveillés en permanence par une caméra de tête dans des conditions de lumière rouge. Les odeurs sont ajoutés à un courant d'air continu de 20 cm / sec et voyagent à travers les tubes de verre à une vitesse constante. Le courant d'air est humidifié par passage à travers flacons de 250 ml contenant de l'eau distillée (humidificateurs) avant d'entrer dans le système de distribution d'odeur. Les positions de flies' sont enregistrées dans une région carrée d'intérêt (ROI) qui englobe la majeure partie de la longueur des tubes d'odeurs (à l'exclusion des bords extérieurs des tubes (environ 5 mm de chaque côté), où les mouches peuvent pas se déplacer plus haut ou vent arrière) à l'époque de la présentation de l'odeur (figure 1A, B). Aller identités sont maintenues constantes par le système de suivi tout au long de l'expérience sur la base de leurs positions Y (ie leurs limites d'tube de verre). Stimulation de l'odeur est réalisé en utilisant un dispositif de stimulation multi-composant qui permet la présentation d'un maximum de 8 et de toutes les odeurs simples mélanges de ceux-ci possibles 26,29 (figure 1B). Le cours d'un essai est commandé par un ordinateur de régulation du système de délivrance et de collecte de l'odeur température et d'humidité de l'information (ordinateur 1, la figure 1C). Cet ordinateur contrôle également un enregistreur de données (démarrage / arrêt de l'enregistrement) sur un deuxième ordinateur qui permet de suivre en permanence les positions de voler à 20 images par seconde (2) informatiques. Fly positions, état ​​de la vanne d'odeur (c.-à-point dans le temps de l'ouverture de la vanne), l'odeur ID, ​​la température et l'humidité autour de cycles de stimulation de l'odeur sont enregistrés sur l'ordinateur 2. De cette façon, des informations sur l'odeur et la mouche positions sont synchronisés et exportés au format .csv fichiers qui peut encore être traitées et analysées en utilisant les routines d'analyse écrite sur mesure. En raisonl'ensemble du système est contrôlé par ordinateur, sans intervention humaine est nécessaire au cours d'une session expérimentale.

Protocol

La construction et les détails techniques de Flywalk ont été décrites ailleurs 26 (en cas de problèmes d'établir cette mise en place, de plus amples informations peuvent être obtenues à partir de MK). Ici nous nous concentrons sur des instructions détaillées sur la manipulation du paradigme qui aidera à obtenir des résultats fiables. 1. Fly Manutention Arrière vole en bas de cultures moyennes de densité sur un milieu alimentaire en vertu d'u…

Representative Results

Étant donné que les mouches sont autorisés à distribuer librement dans leurs tubes de verre entre les impulsions d'odeur et l'impulsion d'odeur se déplace à travers les tubes de verre à une vitesse constante vol rencontrent l'odeur à des moments différents en fonction de leur position-x au moment de la stimulation. En conséquence, les onsets des trajectoires au vent évoqués par une impulsion ms 500 d'une jolie 10 -3 dilution de l'acétate d'éthyle sont décalées d&#39…

Discussion

Bien que le système Flywalk semble assez sophistiqué, à première vue, une fois mis en place et en cours d'exécution, il est facile à utiliser et produit des résultats très robustes. Pour souligner la cohérence des résultats obtenus avec le dosage biologique, on peut dire que les résultats représentatifs présentés ici ont été obtenues presque 2 ans après que certains des résultats présentés dans une étude précédente 29 avec une configuration modifiée à l'aide d'un nouveau l…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Daniel Veit pour l'assistance technique et Pedro Gouveia à Electricidade Em Po (electricidadeempo.net) pour personnaliser le logiciel de suivi de nos demandes. Nous remercions aussi Tom Retzke de soutien pendant le processus de tournage. Cette étude a été soutenue par la Société Max Planck.

Materials

Flywalk setup Custom details available upon request
stimulus device Custom details available upon request
LED cluster Custom details available upon request
HD Pro Webcam C920 Logitech, Lausanne, Switzerland
2 Computers
Flywalk Reloaded v1.0 software Electricidade Em Pó (electricidadeempo.net)
Labview 11.0 software National Instruments, Austin, TX
Standard fly food Custom
Standard fly vials Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany
Standard fly vials Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany
aspirator Custom
mineral oil Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)
odors Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)
200 µl PCR reaction tubes Biozym Scientific GmbH, Oldendorf, Germany

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Citar este artigo
Thoma, M., Hansson, B. S., Knaden, M. High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm. J. Vis. Exp. (106), e53394, doi:10.3791/53394 (2015).

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