Enrichissement de la membrane de Bruch des yeux de donneur humain

Tissus de l'œil humain consenti à des fins de recherche a été obtenu à partir de la Manchester Royal Eye Hospital Eye Bank après l'enlèvement de la cornée pour la transplantation. L'utilisation de tissus humains pour la recherche était en conformité avec la Loi sur les tissus humains (2004) des lignes directrices, et avec l'approbation Comité d'éthique de la recherche universitaire (référence 11305). 1. Enrichissement de la membrane de Bruch entier Nettoyez l'espace de travail autour et sous le microscope de dissection avec 1% de désinfectant (v / v), puis essuyez avec 70% (v / v) d'éthanol. Vérifiez les points suivants sont à portée de main: un nouveau scalpel jetable, deux grattoirs stériles cellulaires (couramment utilisés dans la culture de tissus) et trois paires de pinces (énumérés ici comme A, B, et C, voir la liste des matériaux). Placez le globe oculaire dans une boîte de Petri à usage unique, en conservant le couvercle pour une utilisation ultérieure. Grâce à un nouveau scalpel jetable, retirer tout nerf optique résiduelle, ce qui peut interférer avec la création d'une plate mount du tissu. Ensuite, assurez-quatre incisions également espacées pour créer quatre quadrants, si de passer à la partie 3 (enrichissement de la membrane de Bruch maculaire) ne pas couper à travers la région de la macula. Assurez-vous que les entailles traversent toute la profondeur du tissu oculaire – à partir de la rétine neurosensorielle plus à l'intérieur (NSR), à travers la choroïde et la sclérotique (blanc de l'oeil). Continuer l'incision tout le chemin autour de l'œil de la marge de l'œilleton vers le nerf optique. Cela permettra à l'œilleton d'être aplati (voir la figure 1B). Tenir un quadrant de œilleton aplati en utilisant pince A (pour empêcher le détachement de la choroïde), utiliser la plus grande pince B pour saisir le NSR vitré et sous-jacente et tirez ce tissu loin de l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) à partir de la périphérie, se déplaçant vers le centre de l'œilleton ouvert et ensuite à la partie adverse. Habituellement, mais pas toujours à la fois vitreux et détacher comme une NSR. Utilisez le scalpel à exciser toute NSR résiduelle ancré à la papille. Encore une fois, tout en maintenant un quadrant de tissu en place en utilisant pince A, utiliser le grattoir cellulaire stérile pour déloger doucement la monocouche RPE de la totalité de la surface interne de l'œilleton. Ces cellules se détachent facilement et peuvent être vus touffes brun-pigmentées sombres. Rincer avec du PBS pour laver en douceur les cellules RPE loin délogés de l'œilleton. Ensuite, utilisez pince A à retirez délicatement le tissu rouge foncé recouvrant (comprenant à la fois la membrane de Bruch et la choroïde) de tous les 4 quadrants de l'oeil. Placez le tissu excisé dans un plat propre. En utilisant le bord aplati d'un gratteur de cellules pour maintenir le tissu excisé en place, utilisez le second grattoir pour gratter délicatement le tissu. Tournez le tissu et répéter, en supprimant autant excès de matériau que possible. Finalement, une membrane translucide restera: ceci est la membrane de Bruch grossièrement enrichi. L'utilisation du microscope de dissection à un minimum de grossissement 20X estessentiel en facilitant l'élimination de la choroïde et de l'enrichissement de la membrane de Bruch. Avec une pipette Pasteur, rincer rapidement la membrane de Bruch avec de l'eau ultra pure pour enlever la choroïde résiduelle et de sang avant de placer la membrane dans un tube de 1,5 ml. Suspendre la membrane de Bruch enrichi dans environ 1 ml d'eau ultra pure et brièvement de vortex (environ 15 secondes) pour aider à la lyse cellulaire contaminer toute question (voir la figure 2). Centrifuger l'échantillon à 500 g pendant 30 secondes pour sédimenter la membrane et aspirer le surnageant. Remarque: la membrane de Bruch Le reste enrichi est maintenant prêt pour la solubilisation (comme décrit au paragraphe 2 ci-dessous) ou de stockage à -80 ° C pour une utilisation ultérieure. 2. solubilisation de la membrane et Western Blot Analyse de l'entier enrichi Bruch D'extrait de protéines de la membrane de Bruch enrichi en plongeant le tissu dans 500 pi 8 M urEA pendant 6 heures à la température ambiante dans 1,5 ml microtubes (figure 3A). Centrifuger les échantillons solubilisés à 10 000 xg pendant 10 min pour sédimenter toute matière restante extracellulaire. Retirer le surnageant et le transférer à 3.500 membrane de dialyse MWCO Da, puis placez l'échantillon dans 1 L de PBS pour dialyse pendant 16 heures à 4 ° C. Pour chaque échantillon, ajouter 40 ul de billes d'isolement des protéines, et faire tourner l'échantillon / mélange bourrelet (20 tpm sur un agitateur rotatif) à température ambiante pendant 30 min. Centrifuger les échantillons à 10 000 xg pendant 5 min pour sédimenter les billes. Retirer le surnageant et solubiliser la protéine liée à des billes dans 30 pi de 2 x tampon de charge d'échantillon (65,8 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2,1% de SDS, 26,3% (p / v) de glycerol, 0,01% de bleu de bromophénol, 3% β-mercaptoethanol). Incuber les échantillons à 100 ° C pendant 10 minutes, puis centrifuger à 10 000 xg pendant 5 min pour sédimenter les billes restantes. Chargez le surnageant qui contient les protéines libérées à un pré-casting SDSgel page gradient (voir la liste des matériaux) pour la séparation des protéines. Visualiser les bandes de protéine séparée en utilisant un protocole de coloration commune, par exemple, le bleu de Coomassie. En bref, ajouter 20 ml de la tache bleu brillant (0,1% de bleu brillant (p / v), 50% de méthanol, 10% d'acide acétique glacial, 40% d'eau) sur le gel, et incuber pendant 30 min à température ambiante sous agitation douce . Jeter la solution de coloration et laver le gel coloré avec de l'eau déminéralisée jusqu'à ce que la coloration de fond est suffisamment réduite pour permettre à la protéine teinté bande visualisation. En variante, le transfert séparé des bandes de protéines sur de la nitrocellulose pour analyse western, comme décrit ci-dessous. Transfert séparé bandes de protéines sur une membrane de nitrocellulose à 80 mA pendant 2,5 heures en utilisant un appareil de transfert semi-sec dans un tampon de transfert (25 mM de Tris, 192 mM de glycine, 10% [v / v] méthanol). Bloquer la membrane dans 10 ml de PBS, 10% (p / v) de lait, et 0,02% (p / v) de BSA pendant 16 heures à 4 ° C avant the addition des anticorps primaires souhaitées pour la détection de protéine. Remarque: Par exemple ici, la figure 3C montre un immunotransfert représentatif de la membrane de Bruch solubilisation de trois donneurs distincts sondé pour un régulateur de la cascade du complément, le facteur H-like protein 1 (FHL-1). 3. Enrichissement de la membrane de Bruch maculaire Suivre les étapes 1,1 – 1,3, comme décrit précédemment. Alors que le NSR est toujours en place, localiser la fovéa coloration jaune qui représente la région de la macula centrale (voir Figure 4). Utilisation d'un 6 mm biopsie poinçon stérile, placer au-dessus de la région de la fovéa et couper fermement dans la macula. Garder le poinçon de biopsie en place, faire une incision séparée avec un scalpel à partir du bord de l'œilleton vers le bord de la lame biopsie punch, puis en utilisant pince B, décoller la matière environnante oeil à réaliser une biopsie propre. Utilisation pince C, supprimerle disque de 6 mm de tissu du poinçon et le placer sur le couvercle de la boîte de Pétri propre. Placez le couvercle de boîte de Pétri et de punch maculaire sous le microscope de dissection. Retirez le disque NSR mince (vérifier jaune fovéale coloration de déduire exactitude de biopsie). Utilisez un grattoir à cellules stérile pour enlever délicatement les cellules de l'EPR. Fixez le disque maculaire via la sclérotique en utilisant les conseils de pince A, et pelez lentement la choroïde et le complexe de la membrane de Bruch utilisant pince C. Encore une fois, utiliser le grattoir de cellules pour enlever la choroïde indésirables et de la matière de sang de la membrane de Bruch. Placez la membrane de Bruch maculaire dans un tube de 1,5 ml et de suspendre dans 1 ml d'eau ultra-pure. Vortex brièvement (environ 15 secondes) pour aider à la lyse cellulaire contaminer toute question. Centrifuger l'échantillon à 500 g pendant 30 secondes pour sédimenter la membrane et aspirer le surnageant. Note: La membrane de Bruch enrichi isolé de la macula peut maintenant être utilisé pour un protéomiquealy en utilisant des protocoles de digestion préférées de l'utilisateur.