Verrijking van Bruch's membraan van Human Donor Eyes

Menselijk oogweefsel toestemming voor onderzoeksdoeleinden werd verkregen uit de Manchester Royal Eye Hospital Eye Bank na verwijdering van het hoornvlies voor transplantatie. Het gebruik van menselijke weefsels voor onderzoek in overeenstemming was met de Human Tissue Act (2004) richtlijnen, en met instemming van de Universiteit Research Ethics Committee (referentie 11305). 1. Verrijking van Whole Bruch's membraan Reinig de werkruimte rond en onder de dissectiemicroscoop met 1% desinfecterend middel (v / v) en veeg omlaag met 70% (v / v) ethanol. Zorg ervoor dat de volgende bij de hand: een nieuwe disposable scalpel, twee steriele cel scrapers (vaak gebruikt in weefselkweek) en drie paar pincet (hier vermeld als A, B en C, zie lijst materialen). Plaats de oogbol in een wegwerp petrischaal, behoud van de deksel voor later gebruik. Met behulp van een nieuwe disposable scalpel, verwijder eventueel resterende oogzenuw, die kunnen interfereren met het creëren van een vlakke mount van het weefsel. Maak vervolgens vier insnijdingen gelijke afstand van elkaar tot vier kwadranten te maken, als u doorgaat met deel 3 (verrijking van macula Bruch's membraan) niet dwars door de macula regio. Ervoor zorgen dat de insnijdingen zich door de gehele diepte van het oogweefsel – van de binnenste neurosensorische retina (NSR), door de choroid en sclera (oogwit). Blijven de incisie helemaal door het oog van de marge van de oogschelp aan de oogzenuw. Hierdoor kan de oogschelp te worden afgevlakt (zie figuur 1B). Die één kwadrant van afgeplatte oogschelp met pincet A (tot choroïdea onthechting te voorkomen), gebruik maken van de grotere pincet B grip het glasvocht en de onderliggende NSR en trek dit weefsel weg van de retina pigment epitheel (RPE) vanaf de periferie, op weg naar het centrum van de geopende oogschelp en vervolgens aan de tegenoverliggende kant. Meestal, maar niet altijd, zowel glasvocht en NSR los als één. Gebruik de Scalpel om eventuele NSR verankerd op de optische schijf accijnzen. Nogmaals, terwijl die een kwadrant weefsel vast met pincet A Gebruik de steriele celschraper zachtjes los het RPE monolaag van het gehele binnenoppervlak van de oogschelp. Deze cellen gemakkelijk los en kan worden gezien als donkerbruine gepigmenteerde klonten. Spoelen met PBS om zachtjes weg te spoelen verdreven RPE cellen uit de oogschelp. Gebruik vervolgens een pincet om voorzichtig afpellen de bovenliggende donkerrood weefsel (zowel Bruch's membraan en de choroidea) uit alle 4 de gaten kwadranten. Plaats de weggesneden weefsel in een schone schotel. Met behulp van de afgeplatte rand van een cel schraper om het uitgesneden weefsel zijn plaats te houden, gebruik maken van de tweede schraper om voorzichtig schrapen het weefsel. Draai het weefsel boven en herhaal, het verwijderen van zo veel overtollig materiaal mogelijk. Uiteindelijk zal een doorschijnend membraan blijft: dit is de grof verrijkte membraan van Bruch. Het gebruik van de dissectiemicroscoop ten minste 20X vergrotingessentieel ondersteuning van de verwijdering van vaatvlies en verrijking van Bruch's membraan. Met behulp van een Pasteur pipet kort spoel het membraan van Bruch met ultrapuur water om resterend vaatvlies en bloed te verwijderen voordat het membraan in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Suspendeer de verrijkte membraan van Bruch ongeveer 1 ml ultrazuiver water en vortex kort (ongeveer 15 sec) om lyseren verontreinigend cellulair materiaal (zie figuur 2). Centrifugeer het monster bij 500 xg gedurende 30 seconden aan het membraan pellet en zuig van de supernatant. Opmerking: De resterende verrijkte Bruch's membraan is nu klaar voor solubilisatie later (zoals beschreven in paragraaf 2 hieronder) of opslag bij -80 ° C voor gebruik. 2. Oplossen van Whole verrijkte Bruch's membraan en Western Blot Analyse Uittreksel eiwit uit verrijkte Bruch's membraan door dompelen van het weefsel in 500 pi 8 M urEA 6 uur bij kamertemperatuur in 1,5 ml microcentrifuge buisjes (figuur 3A). Centrifugeer opgeloste monsters bij 10.000 xg gedurende 10 min om alle resterende extracellulaire aangelegenheid pellet. Verwijder het supernatant en overbrengen naar 3.500 Da MWCO dialysemembraan en plaats het monster in 1 liter PBS gedialyseerd gedurende 16 uur bij 4 ° C. Voor elk monster, voeg 40 ul proteïne isolatieparels en draai monster / bead mix (20 rpm op een roterende mixer) bij KT gedurende 30 min. Centrifugeer monsters bij 10.000 xg gedurende 5 minuten om de kralen pellet. Verwijder supernatant en oplosbaar eiwit gebonden aan korrels in 30 ul 2x monster laadbuffer (65,8 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2,1% SDS, 26,3% (w / v) glycerol, 0,01% broomfenolblauw, 3% β-mercaptoethanol). Incubeer de monsters bij 100 ° C gedurende 10 min, en centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 5 minuten om de resterende korrels pellet. Laad het supernatant dat de vrijgemaakte eiwitten op een pre-cast bevat SDS-pagina gradiënt gel (zie lijst) voor het eiwit scheiden. Visualiseren gescheiden eiwitbanden met behulp van een gemeenschappelijke kleuringsprotocol, bijvoorbeeld, Coomassie blauw. Kortom, voeg 20 ml van de briljante blauwe vlek (0,1% brilliant blue (w / v), 50% methanol, 10% ijsazijn, 40% water) aan de gel en incubeer gedurende 30 min bij kamertemperatuur onder zacht schudden . Gooi de kleuroplossing en was de gekleurde gel met gedemineraliseerd water totdat achtergrond kleuring voldoende wordt gereduceerd tot lood eiwit band visualisatie mogelijk te maken. Alternatief overdracht gescheiden eiwitbanden op nitrocellulose voor Western-analyse, zoals hieronder beschreven. Transfer gescheiden eiwitbanden op nitrocellulosemembraan bij 80 mA gedurende 2,5 uur gebruik halfdroog overdrachtsapparaat in overdrachtsbuffer (25 mM Tris, 192 mM glycine, 10% [v / v] methanol). Blokkeer het membraan in 10 ml PBS, 10% (w / v) melk en 0,02% (w / v) BSA gedurende 16 uur bij 4 ° C vóór the toevoeging van de gewenste primaire antilichamen voor eiwitdetectie. Opmerking: Als voorbeeld, Figuur 3C toont een representatieve immunoblot van het gesolubiliseerde membraan van Bruch drie afzonderlijke donoren gezocht heeft naar een regulator van de complement cascade, factor H-achtig eiwit 1 (FHL-1). 3. Verrijking van Macula Bruch's membraan Volg stap 1,1 – 1,3 zoals eerder beschreven. Terwijl de NSR is nog steeds op zijn plaats, zoek de gele foveale kleur die de centrale macula regio (zie figuur 4) vertegenwoordigt. Met behulp van een steriele 6 mm biopsie punch, plaats deze boven de foveale regio en stevig snijden in om de macula. Het bijhouden van de biopsie punch op zijn plaats, maak een aparte incisie met een scalpel vanaf de rand van de oogschelp aan de rand van de biopsie punch blade, en vervolgens met behulp van pincet B, afpellen de omringende oog materiaal om een ​​schone biopsie te bereiken. Met behulp van pincet C, verwijderende 6 mm schijf van weefsel uit de punch en plaats op de schone petrischaal deksel. Plaats de petrischaal deksel en macula stempel onder de microscoop ontleden. Verwijder de dunne NSR schijf (controleer gele foveal kleuring om de nauwkeurigheid van de biopsie afleiden). Gebruik een steriele celschraper om voorzichtig verwijderen van de RPE cellen. Zet de macula disc via de sclera met behulp van de tips van een pincet, en langzaam loskomen van het vaatvlies en de membraan van Bruch complex met pincet C. Ook gebruiken de cel schraper om ongewenste choroidea en bloed kwestie van Bruch's membraan verwijderen. Plaats de macula Bruch's membraan in een 1,5 ml microcentrifugebuis en schorten in 1 ml ultrapuur water. Vortex kort (ongeveer 15 sec) te helpen lyseren eventuele besmetting van cellulaire materie. Centrifugeer het monster bij 500 xg gedurende 30 seconden aan het membraan pellet en zuig van de supernatant. Opmerking: Het verrijkte Bruch's membraan geïsoleerd uit de macula kan nu gebruikt worden voor een proteomischealysis behulp voorkeur spijsvertering protocollen van de gebruiker.