Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.
Mottakelighet for nevron celledød knyttet til neurodegenerering og iskemi er overmåte økte i alderen hjernen, men mekanismene som er ansvarlig er dårlig kjent. Eksitotoksisitet, en prosess som antas å bidra til neuron skade indusert av begge fornærmelser, medieres ved aktivering av glutamatreseptorer som fremmer innstrømning av Ca 2+ og mitokondrielle Ca 2+ overbelastning. En vesentlig endring i intracellulær Ca 2+ homeostase eller ombygging av intracellulær Ca 2+ homeostase kan favorisere nevron skader i gamle nerveceller. For å undersøke Ca 2+ ombygging i aldring har vi brukt levende celle bildebehandling i langsiktige kulturer av rotte hippocampus nevroner som ligner i noen aspekter i alderen nevroner in vivo. For dette formål, hippocampus celler er, i første omgang, fersk spredt fra nye født rotte hippocampi og belagt på poli-D-lysin belagt, dekkglass. Deretter kulturer blir holdt i kontrollerte medier i flere dager eller flere weeks for å undersøke unge og gamle nevroner, henholdsvis. For det andre er dyrkede nerveceller lastet med fura2 og underkastet målinger av cytosoliske Ca 2+ konsentrasjon ved hjelp av digital bildebehandling fluorescens-forholdet. For det tredje, er dyrkede nerveceller transfektert med plasmider som uttrykker en tandem med lav affinitet aequorin og GFP målrettet til mitokondriene. Etter 24 timer er aequorin inne celler rekonstituert med coelenterazine og nevroner er utsatt for bioluminescens avbildning for overvåking av mitokondrielle Ca 2+ konsentrasjon. Denne tre-trinns prosedyre tillater overvåking av cytosolisk og mitokondrielle Ca 2+ responser til relevante stimuli som for eksempel glutamat-reseptor-agonist NMDA og sammenligne hvorvidt disse og andre responser blir påvirket ved aldring. Denne fremgangsmåten kan gi ny innsikt med hensyn til hvordan aldring påvirker cytosoliske og mitokondrielle Ca 2+ respons på utvalgte stimuli, samt testing av utvalgte medikamenter for å forebygge celle neurondødsfall i aldersrelaterte sykdommer.
Eksitotoksisitet er en av de viktigste mekanismer som bidrar til neuronal skade og celledød i nevrologiske fornærmelser slik som iskemi, og i visse nevrodegenerative sykdommer slik som Alzheimers sykdom 1. Denne typen neurotoksisitet er hovedsakelig mediert av glutamat virker på Ca 2+ -permeable, ionotrope NMDA reseptorer (NMDAR) 2. Eksponering av dyrkede neuroner overfor glutamat kan føre til eksitotoksisitet 3, noe som fører til neuronal apoptose 4. Vi og andre har tidligere rapportert at sårbarheten for neuronal NMDA-indusert apoptose kan endre seg med utvikling av in vitro og aldring 5-8.
Det er allment akseptert at en økning i cytosol-fri Ca2 + konsentrasjon ([Ca2 +] cyt) fører til celler aktivering. Men hvis denne økningen er for høy og / eller vedvarende nok, kan det utløse celledød 9. Videre har det vært foreslåttsom eksitotoksisitet krever mitokondrielle Ca 2+ opptak 10, ettersom behandle nerveceller med en mitokondriell uncoupler beskyttet neuroner mot glutamat-indusert celledød 11. Dersom mitokondrier ta opp for mye av Ca 2+, kan åpningen av mitokondriell permeabilitet overgangen pore forekomme, som fører til frigivelse av cytokrom c og andre pro-apoptotiske faktorer, og induserer apoptose. Vi har nylig vist at denne mitokondrielle Ca 2+ opptak er direkte relatert til den aldersavhengig følsomhet for eksitotoksisitet, ved å måle NMDA-indusert mitokondrielle Ca 2+ opptaket i enkelt hippocampale neuroner 5, en fremgangsmåte som er rapportert i denne artikkelen. Hippocampus, som er involvert i fysiologiske prosesser som læring, hukommelse og andre kognitive prosesser 12, er svært sårbare for aldring og nevrodegenerative lidelser 13. Det er foreslått at det etter flere uker i vitro, kultiverthippocampus nevroner viser en rekke typiske kjennetegn ved alderen nevroner 14. Følgelig kan langsiktige dyrkede hippocampus nevroner gi en helhetlig modell for å undersøke Ca 2 + medierte mekanismer for forbedret excitotoxicity i aldring.
Det overordnede målet med metoden som presenteres er derfor å undersøke vesentlige endringer i intracellulær Ca 2+ homeostase eller Ca 2+ ombygging i den aldrende hjernen inkludert differensial Ca 2+ responser utløst av NMDA reseptor agonister i et langsiktig dyrkede hippocampus nevroner . Fremgangsmåten omfatter en detaljert beskrivelse av kulturen i rotte hippocampus-neuroner og overvåking av cytosoliske og mitokondrielle Ca 2+ konsentrasjon av fluorescens og bioluminescens avbildning i individuelle neuroner, respektivt. Fluorescens avbildning av cytosoliske Ca 2+ i dyrkede nerveceller er en standard prosedyre. Imidlertid er denne metode mindre pålitelige for subcellular Ca 2+ målinger inkludert mitokondrielle Ca 2+. Grunner til dette kan være mangel på riktig målretting av syntetiske prober og upassende affinitet for Ca 2 + konsentrasjoner som kan endre i mitokondriene fra lav mikrometer nivå selv til mM nivå. Bruken av Ca 2+ prober basert på proteiner som for eksempel aequorin, har tillatt målretting til subcellulære organeller og bruk av derivater ulike Ca 2+ slektskap med forskjellige coelenterazines eller muterte sonder mangler spesifikk Ca 2+ bindingsseter 15. På denne måte kan bioluminescens avbildning av celler som uttrykker mitokondrier rettede aequorin tillate overvåking av mitokondrielle Ca 2 + konsentrasjoner i de enkelte neuroner. Likevel kan denne fremgangsmåten krever bruk av fotontelling kameraer eller ultrasensitive CCD-kameraer for bioluminescens avbildning 16-18. Denne metoden kan gi nye resultater som bør bekreftes i flere etablsvekket hjernens aldring modeller som, for eksempel, hjerneskiver fra gamle dyr.
Ombygging av intracellulær Ca 2+ homeostase i den aldrende hjernen har vært knyttet til kognitiv tap, økt mottakelighet for iskemisk skade, excitotoxicity og neurodegenerering. For å undersøke denne hypotesen in vitro, Ca 2+ bildebehandling prosedyrer er tilgjengelige. Dessverre, levedyktige kulturer av gamle hippocampus nevroner er ikke pålitelige. Nylig har det blitt observert at langtidskulturer av rotte-hippocampus-neuroner til stede mange av de typiske kjennetegnene ved aldring …
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by Ministerio de Economìa y competitividad (BFU2012-37146) and Junta de Castilla y Leòn (BIO103/VA45/11, VA145U13 and BIO/VA33/13), Spain. MCR was supported by Junta de Castilla y Leòn (Spain) and the European Social Fund. We thank the late Dr. Philippe Brûlet (1947-2013) for the mitochondrial GFP Aequorin plasmid.
Neurobasal Culture Medium | Gibco | 21103-049 | |
HBSS medium | Gibco | 14170-088 | |
Ham's F-12 medium | Gibco | 31330-038 | |
DNase I (from bovine pancreas) | Sigma | D5025-15KU | |
Fetal Bobine Serum | Lonza | DE14-801E | |
B27 | Gibco | 17504-044 | |
Gentamicin | Gibco | 15750 | |
L-glutamine | Gibco | 25030-032 | |
12 mm glass coverslips | Labolan | 0111520/20012 | |
Papain | Worthington | LS003127 | |
4-well multidish plaques | Nunc | 176740 | |
Petry dishes | JD Catalan s.l. | 2120044T | |
Sterile pipettes | Fisher Scientific | 431030 | |
Fura2-AM | Life Technologies | F1201 | |
Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
Coelenterazine n | Biotium | BT-10115-2250 uG | |
Digitonin | Sigma | D5628 | |
NMDA | Sigma | M3262 | |
Glycine | Sigma | 50046 | |
Zeiss Axiovert S100 TV microscope | Carl Zeiss Inc. | ||
Xcite ilumination system | EXFO | ||
ORCA ER fluorescence camera | Hamamatsu | ||
VIM photon counting CCD camera | Hamamatsu | ||
VC-8 valve controller | Warner Instruments | ||
SH-27B heating system | Warner Instruments | ||
Aquacosmos Software | Hamamatsu Photonics |