Fluorescens og Bioluminesens Imaging av subcellulære Ca²⁺ I Aged hippocampus nevroner

Eksitotoksisitet er en av de viktigste mekanismer som bidrar til neuronal skade og celledød i nevrologiske fornærmelser slik som iskemi, og i visse nevrodegenerative sykdommer slik som Alzheimers sykdom ^1. Denne typen neurotoksisitet er hovedsakelig mediert av glutamat virker på Ca ²⁺ -permeable, ionotrope NMDA reseptorer (NMDAR) ^2. Eksponering av dyrkede neuroner overfor glutamat kan føre til eksitotoksisitet ^3, noe som fører til neuronal apoptose ^4. Vi og andre har tidligere rapportert at sårbarheten for neuronal NMDA-indusert apoptose kan endre seg med utvikling av in vitro og aldring ^5-8.

Det er allment akseptert at en økning i cytosol-fri ^Ca2 + konsentrasjon ^([Ca2 +] _cyt) fører til celler aktivering. Men hvis denne økningen er for høy og / eller vedvarende nok, kan det utløse celledød ^9. Videre har det vært foreslåttsom eksitotoksisitet krever mitokondrielle Ca ²⁺ opptak ^10, ettersom behandle nerveceller med en mitokondriell uncoupler beskyttet neuroner mot glutamat-indusert celledød ^11. Dersom mitokondrier ta opp for mye av Ca ^2+, kan åpningen av mitokondriell permeabilitet overgangen pore forekomme, som fører til frigivelse av cytokrom c og andre pro-apoptotiske faktorer, og induserer apoptose. Vi har nylig vist at denne mitokondrielle Ca ²⁺ opptak er direkte relatert til den aldersavhengig følsomhet for eksitotoksisitet, ved å måle NMDA-indusert mitokondrielle Ca ²⁺ opptaket i enkelt hippocampale neuroner ^5, en fremgangsmåte som er rapportert i denne artikkelen. Hippocampus, som er involvert i fysiologiske prosesser som læring, hukommelse og andre kognitive prosesser ^12, er svært sårbare for aldring og nevrodegenerative lidelser ^13. Det er foreslått at det etter flere uker i vitro, kultiverthippocampus nevroner viser en rekke typiske kjennetegn ved alderen nevroner ^14. Følgelig kan langsiktige dyrkede hippocampus nevroner gi en helhetlig modell for å undersøke Ca ^{2 +} medierte mekanismer for forbedret excitotoxicity i aldring.

Det overordnede målet med metoden som presenteres er derfor å undersøke vesentlige endringer i intracellulær Ca ²⁺ homeostase eller Ca ²⁺ ombygging i den aldrende hjernen inkludert differensial Ca ²⁺ responser utløst av NMDA reseptor agonister i et langsiktig dyrkede hippocampus nevroner . Fremgangsmåten omfatter en detaljert beskrivelse av kulturen i rotte hippocampus-neuroner og overvåking av cytosoliske og mitokondrielle Ca ²⁺ konsentrasjon av fluorescens og bioluminescens avbildning i individuelle neuroner, respektivt. Fluorescens avbildning av cytosoliske Ca ²⁺ i dyrkede nerveceller er en standard prosedyre. Imidlertid er denne metode mindre pålitelige for subcellular Ca ²⁺ målinger inkludert mitokondrielle Ca ^2+. Grunner til dette kan være mangel på riktig målretting av syntetiske prober og upassende affinitet for Ca ^{2 +} konsentrasjoner som kan endre i mitokondriene fra lav mikrometer nivå selv til mM nivå. Bruken av Ca ²⁺ prober basert på proteiner som for eksempel aequorin, har tillatt målretting til subcellulære organeller og bruk av derivater ulike Ca ²⁺ slektskap med forskjellige coelenterazines eller muterte sonder mangler spesifikk Ca ²⁺ bindingsseter ^15. På denne måte kan bioluminescens avbildning av celler som uttrykker mitokondrier rettede aequorin tillate overvåking av mitokondrielle Ca ^{2 +} konsentrasjoner i de enkelte neuroner. Likevel kan denne fremgangsmåten krever bruk av fotontelling kameraer eller ultrasensitive CCD-kameraer for bioluminescens avbildning ^16-18. Denne metoden kan gi nye resultater som bør bekreftes i flere etablsvekket hjernens aldring modeller som, for eksempel, hjerneskiver fra gamle dyr.