Fluorescence et bioluminescence imagerie des Subcellular Ca²⁺ In Aged neurones de l'hippocampe

L'excitotoxicité est l'un des mécanismes les plus importants qui contribuent à une lésion neuronale et la mort cellulaire dans injurieux neurologiques tels que l'ischémie, et dans certaines maladies neurodégénératives telles que la maladie d'Alzheimer ^1. Ce type de neurotoxicité est principalement médiée par le glutamate agissant sur ​​Ca ²⁺ -permeable, les récepteurs NMDA (NMDAR ionotropique) ^2. L'exposition des neurones cultivés à glutamate peut entraîner des excitotoxicité ^3, ce qui provoque l'apoptose neuronale ^4. Nous et d'autres avons précédemment rapporté que la vulnérabilité neuronale à l'apoptose induite par le NMDA peut changer avec le développement in vitro et le vieillissement de ^5-8.

Il est largement admis que l'augmentation de la libre ^{cytosolique-concentration} de Ca 2+ ([Ca ^2+] _CYT) conduit à l'activation des cellules. Toutefois, si cette hausse est trop élevée et / ou assez soutenue, il peut déclencher la mort cellulaire ^9. En outre, il a été proposéque excitotoxicité nécessite Ca ²⁺ mitochondrial absorption ^10, puisque le traitement des neurones avec un neurones découplant mitochondrial protégées contre induite par le glutamate mort cellulaire ^11. Si mitochondries prennent trop de ^Ca 2+, de l'ouverture du pore de transition mitochondrial perméabilité peut se produire, conduisant à la libération de cytochrome c et d'autres facteurs pro-apoptotiques, et induisant l'apoptose. Nous avons récemment montré que cette mitochondrial ^Ca2 + absorption est directement liée à la sensibilité dépendant de l'âge à l'excitotoxicité, en mesurant directement NMDA induite par ^Ca2 + mitochondrial absorption dans les neurones hippocampiques ^{individuelles} 5, un procédé qui est indiqué dans cet article. L'hippocampe, impliquée dans les processus physiologiques tels que l'apprentissage, la mémoire et d'autres processus cognitifs ^12, est très vulnérable au vieillissement et les troubles neurodégénératifs ^13. Il a été proposé que, après plusieurs semaines in vitro, en cultureneurones de l'hippocampe montrent un certain nombre de caractéristiques typiques des neurones ^âgées de 14. En conséquence, les neurones d'hippocampe en culture à long terme peuvent fournir un modèle global pour enquêter Ca ²⁺ mécanismes médiées de excitotoxicité accrue dans le vieillissement.

L'objectif global de la méthode présentée est, par conséquent, pour enquêter sur des changements substantiels dans l'homéostasie intracellulaire ^de Ca2 + ou Ca ²⁺ remodelage dans le vieillissement du cerveau, y compris ^les réponses de l'écart Ca induites par des agonistes des récepteurs NMDA dans un long-terme neurones d'hippocampe en culture . Le procédé comprend une description détaillée de la culture des neurones d'hippocampe de rat et de la surveillance des concentrations ^de Ca2 + cytosolique et mitochondriale par fluorescence et l'imagerie par bioluminescence dans les neurones individuels, respectivement. Imagerie de fluorescence de ^Ca2 + cytosolique dans des neurones en culture est une procédure standard. Cependant, cette méthode est moins fiable pour souscellulaire, y compris les mesures ^de Ca2 + mitochondrial Ca ^2+. Les raisons en sont le manque de ciblage des sondes synthétiques et d'affinité inapproprié pour ^{concentrations} de Ca2 + qui peuvent changer dans les mitochondries du niveau de iM faible, même au niveau mM. L'utilisation de ^Ca 2+ sondes à base de protéines comme par exemple l'aequorine, a permis de cibler les organelles subcellulaires et à l'utilisation de dérivés différentes affinités ^Ca2 + en utilisant différentes sondes ou cœlentérazines mutées dépourvues de Ca ²⁺ spécifique ¹⁵ sites de liaison. De cette manière, l'imagerie par bioluminescence de cellules exprimant l'aequorine mitochondriale ciblée peut permettre le contrôle des concentrations ^de Ca2 + mitochondrial dans des neurones individuels. Pourtant, cette procédure peut nécessiter l'utilisation de caméras de comptage de photons ou des caméras CCD ultrasensibles pour la bioluminescence imagerie ^16-18. Cette méthode peut donner de nouveaux résultats qui devraient être confirmée dans plus establMINE modèles de vieillissement du cerveau que, par exemple, des tranches de cerveau de vieux animaux.