Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.
La sensibilité à la mort cellulaire neuronale associée à la neurodégénérescence et l'ischémie sont extrêmement augmentée dans le cerveau mais vieilli mécanismes responsables sont mal connus. L'excitotoxicité, un processus censé contribuer à des lésions des neurones induite par les deux injurieux, est médiée par l'activation des récepteurs du glutamate, qui favorise l'influx de Ca2 + et Ca2 + mitochondrial surcharge. Un changement important dans l'homéostasie intracellulaire de Ca2 + ou remodelage de Ca2 + intracellulaire homéostasie peut favoriser des dommages neurone dans les vieux neurones. Pour étudier le remodelage de Ca2 + dans le vieillissement, nous avons utilisé l'imagerie de cellules vivantes dans les cultures à long terme de neurones hippocampiques de rat qui ressemblent à certains égards neurones in vivo âgés. Pour cette fin, cellules de l'hippocampe sont, en premier lieu, fraîchement dispersé de nouvelles hippocampes né de rat et plaqués sur des lamelles couché, verre poli-D-lysine. Puis les cultures sont conservés dans les médias contrôlés pendant plusieurs jours ou plusieurs wEeks pour enquêter jeunes et vieux neurones, respectivement. Deuxièmement, des neurones en culture sont chargés avec fura2 et soumis à des mesures de la concentration cytosolique de Ca2 + en utilisant l'imagerie de fluorescence de rapport numérique. Troisièmement, des neurones en culture sont transfectées avec des plasmides exprimant un tandem de faible affinité équorine et la GFP ciblée vers les mitochondries. Après 24 heures, l'aequorine l'intérieur des cellules est reconstitué avec coelentérazine et les neurones sont soumis à l'imagerie par bioluminescence pour la surveillance de la concentration en Ca2 + mitochondrial. Cette procédure en trois étapes permet la surveillance des réponses mitochondriaux et cytosoliques Ca2 + à des stimuli appropriés comme par exemple l'agoniste des récepteurs du glutamate NMDA et de comparer si ces réponses et d'autres sont influencés par le vieillissement. Cette procédure peut donner de nouvelles indications sur la façon dont le vieillissement influence cytosolique et les réponses Ca 2+ mitochondriales à des stimuli sélectionnés ainsi que les essais de médicaments sélectionnés visant à prévenir neuronela mort dans les maladies liées à l'âge.
L'excitotoxicité est l'un des mécanismes les plus importants qui contribuent à une lésion neuronale et la mort cellulaire dans injurieux neurologiques tels que l'ischémie, et dans certaines maladies neurodégénératives telles que la maladie d'Alzheimer 1. Ce type de neurotoxicité est principalement médiée par le glutamate agissant sur Ca 2+ -permeable, les récepteurs NMDA (NMDAR ionotropique) 2. L'exposition des neurones cultivés à glutamate peut entraîner des excitotoxicité 3, ce qui provoque l'apoptose neuronale 4. Nous et d'autres avons précédemment rapporté que la vulnérabilité neuronale à l'apoptose induite par le NMDA peut changer avec le développement in vitro et le vieillissement de 5-8.
Il est largement admis que l'augmentation de la libre cytosolique-concentration de Ca 2+ ([Ca 2+] CYT) conduit à l'activation des cellules. Toutefois, si cette hausse est trop élevée et / ou assez soutenue, il peut déclencher la mort cellulaire 9. En outre, il a été proposéque excitotoxicité nécessite Ca 2+ mitochondrial absorption 10, puisque le traitement des neurones avec un neurones découplant mitochondrial protégées contre induite par le glutamate mort cellulaire 11. Si mitochondries prennent trop de Ca 2+, de l'ouverture du pore de transition mitochondrial perméabilité peut se produire, conduisant à la libération de cytochrome c et d'autres facteurs pro-apoptotiques, et induisant l'apoptose. Nous avons récemment montré que cette mitochondrial Ca2 + absorption est directement liée à la sensibilité dépendant de l'âge à l'excitotoxicité, en mesurant directement NMDA induite par Ca2 + mitochondrial absorption dans les neurones hippocampiques individuelles 5, un procédé qui est indiqué dans cet article. L'hippocampe, impliquée dans les processus physiologiques tels que l'apprentissage, la mémoire et d'autres processus cognitifs 12, est très vulnérable au vieillissement et les troubles neurodégénératifs 13. Il a été proposé que, après plusieurs semaines in vitro, en cultureneurones de l'hippocampe montrent un certain nombre de caractéristiques typiques des neurones âgées de 14. En conséquence, les neurones d'hippocampe en culture à long terme peuvent fournir un modèle global pour enquêter Ca 2+ mécanismes médiées de excitotoxicité accrue dans le vieillissement.
L'objectif global de la méthode présentée est, par conséquent, pour enquêter sur des changements substantiels dans l'homéostasie intracellulaire de Ca2 + ou Ca 2+ remodelage dans le vieillissement du cerveau, y compris les réponses de l'écart Ca induites par des agonistes des récepteurs NMDA dans un long-terme neurones d'hippocampe en culture . Le procédé comprend une description détaillée de la culture des neurones d'hippocampe de rat et de la surveillance des concentrations de Ca2 + cytosolique et mitochondriale par fluorescence et l'imagerie par bioluminescence dans les neurones individuels, respectivement. Imagerie de fluorescence de Ca2 + cytosolique dans des neurones en culture est une procédure standard. Cependant, cette méthode est moins fiable pour souscellulaire, y compris les mesures de Ca2 + mitochondrial Ca 2+. Les raisons en sont le manque de ciblage des sondes synthétiques et d'affinité inapproprié pour concentrations de Ca2 + qui peuvent changer dans les mitochondries du niveau de iM faible, même au niveau mM. L'utilisation de Ca 2+ sondes à base de protéines comme par exemple l'aequorine, a permis de cibler les organelles subcellulaires et à l'utilisation de dérivés différentes affinités Ca2 + en utilisant différentes sondes ou cœlentérazines mutées dépourvues de Ca 2+ spécifique 15 sites de liaison. De cette manière, l'imagerie par bioluminescence de cellules exprimant l'aequorine mitochondriale ciblée peut permettre le contrôle des concentrations de Ca2 + mitochondrial dans des neurones individuels. Pourtant, cette procédure peut nécessiter l'utilisation de caméras de comptage de photons ou des caméras CCD ultrasensibles pour la bioluminescence imagerie 16-18. Cette méthode peut donner de nouveaux résultats qui devraient être confirmée dans plus establMINE modèles de vieillissement du cerveau que, par exemple, des tranches de cerveau de vieux animaux.
Le remodelage de Ca 2+ intracellulaire homéostasie dans le cerveau de vieillissement a été liée à la perte cognitive, une susceptibilité accrue aux lésions ischémiques, excitotoxicité et la neurodégénérescence. Pour vérifier cette hypothèse in vitro, les procédures d'imagerie de CA sont disponibles. Malheureusement, cultures viables de vieux neurones de l'hippocampe ne sont pas fiables. Récemment, il a été observé que les cultures à long terme de neurones d'…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by Ministerio de Economìa y competitividad (BFU2012-37146) and Junta de Castilla y Leòn (BIO103/VA45/11, VA145U13 and BIO/VA33/13), Spain. MCR was supported by Junta de Castilla y Leòn (Spain) and the European Social Fund. We thank the late Dr. Philippe Brûlet (1947-2013) for the mitochondrial GFP Aequorin plasmid.
Neurobasal Culture Medium | Gibco | 21103-049 | |
HBSS medium | Gibco | 14170-088 | |
Ham's F-12 medium | Gibco | 31330-038 | |
DNase I (from bovine pancreas) | Sigma | D5025-15KU | |
Fetal Bobine Serum | Lonza | DE14-801E | |
B27 | Gibco | 17504-044 | |
Gentamicin | Gibco | 15750 | |
L-glutamine | Gibco | 25030-032 | |
12 mm glass coverslips | Labolan | 0111520/20012 | |
Papain | Worthington | LS003127 | |
4-well multidish plaques | Nunc | 176740 | |
Petry dishes | JD Catalan s.l. | 2120044T | |
Sterile pipettes | Fisher Scientific | 431030 | |
Fura2-AM | Life Technologies | F1201 | |
Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
Coelenterazine n | Biotium | BT-10115-2250 uG | |
Digitonin | Sigma | D5628 | |
NMDA | Sigma | M3262 | |
Glycine | Sigma | 50046 | |
Zeiss Axiovert S100 TV microscope | Carl Zeiss Inc. | ||
Xcite ilumination system | EXFO | ||
ORCA ER fluorescence camera | Hamamatsu | ||
VIM photon counting CCD camera | Hamamatsu | ||
VC-8 valve controller | Warner Instruments | ||
SH-27B heating system | Warner Instruments | ||
Aquacosmos Software | Hamamatsu Photonics |