Específica Striatum Cortex, hipocampo, Thalamus-, hipotálamo, núcleo-septal lateral y<em> In Utero</em> Electroporación en el ratón C57BL / 6
Summary
This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.
Abstract
In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.
Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.
Introduction
Desde la primera descripción en 2001 por tres grupos independientes 1-3 i n electroporación utero se ha convertido en una herramienta estándar ampliamente utilizado para el análisis de la expresión génica en el sistema nervioso central de roedores. En comparación con la generación de ratones knock-out, que es, a pesar de la mejora continua de las técnicas, aún de tiempo y dinero que consumen, las apelaciones en el útero de electroporación debido a su simplicidad. Así, en el útero de la electroporación permite ganancia-rápido y eficiente y la pérdida de la función de los estudios 4.
Para transfectar las regiones cerebrales, la solución que contiene el plásmido cargado negativamente se inyecta en un ventrículo. Durante el pulso eléctrico, el ADN cargado negativamente migra hacia el polo positivo y por lo tanto la región transfectadas se puede seleccionar simplemente alterando la posición del polo positivo. Con frecuencia se ha demostrado que numerosas regiones del sistema nervioso central pueden ser targeted 3,5-8. Por ejemplo, estudios recientes muestran transfecciones específicas del hipocampo, la corteza piriforme o el cuerpo estriado 9 a 11. Sin embargo, la información sobre las posiciones adecuadas son a menudo sólo apenas estandarizada y no son siempre fáciles de transferir a diferentes cepas de ratón.
La transfección de ciertas etapas embrionarias está lejos de ser trivial. Son muchos los factores que influyen deben tenerse en cuenta al elegir la puesta a punto para la electroporación específico pt el útero. En primer lugar, para transfectar de manera óptima las respectivas etapas embrionarias, se necesita conocimiento sobre los voltajes apropiados. Altas tensiones disminuyen la tasa de supervivencia, mientras que bajas tensiones reducen el 2,3,12 eficacia de transfección. También el tamaño de la paleta electrodo desempeña un papel crucial, porque el uso de paletas de electrodos que son demasiado grandes resultados en la especificidad reducida o pueden causar la muerte debido a la afección del ritmo cardíaco 4,12,13. El aplicadatensión y el tamaño y la posición de la pala de electrodo son las características más importantes a considerar, pero también hay otros factores que influyen en el resultado de la electroporación, al igual que la cantidad aplicada de ADN-solución.
Hemos desarrollado un protocolo detallado que permite la transfección rápida y eficaz de diversas regiones cerebrales del ratón C57BL / 6 12. En este protocolo de información detallada acerca de las tensiones que se utilizará y se proporciona el tamaño de la paleta de electrodos para la especificidad mejorada. Además, la información sobre el ventrículo para ser llenado junto con recomendaciones para la cantidad de solución de plásmido y la posición del electrodo se suministra. La indicación de la información de posición en un mapa detallado y adicionalmente a la visualización de estas posiciones permite específica sencilla y eficiente en el útero de la electroporación de la corteza retroesplenial, la corteza motora, la corteza somatosensorial, la corteza piriforme t,él Cornu ammonis 1-3 el giro dentado, el cuerpo estriado, el núcleo septal lateral, el tálamo y el hipotálamo.
Protocol
Representative Results
Discussion
This protocol describes in detail how to transfect the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus of C75BL/6 mice. With all the provided information this is the first protocol, which supplies all necessary information to easily recreate transfections of these cerebral regions in the C57BL/6 mouse. Previous publications are mostly focused only on a few specific r…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Technical supported by Melanie Pfeifer and Nikolai Schmarowski (Institute for Microscopic Anatomy and Neurobiology, University Medical Center Mainz).
Materials
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Fast Green | Roth | 0301.1 | |
| pCAGGS | Addgene | ||
| borosilicate glass capillaries (0.8-0.9 mm diameter) | Wold Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
| Isoflurane (Forene) | Abbott | PZN 4831850 | |
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer GmbH | approval number: 400684.00.00 | |
| eye ointment (Bepanthen Augen und Nasensalbe) | Bayer | PZN 01578681 | |
| 0.9% benzyl alcohol 0.9% saline solution | Pharmacy of the University Medical Center Mainz |
||
| gauze (ES-Kompressen) | Hartmann | 407835 | |
| sterile 5-0 Perma-Hand Silk Suture | Ethicon Johnson & Johnson | K890H | |
| ring forceps 1/ 1.5 mm | Fine Science Tools | 11101-09 | |
| ring forceps 4.8/ 6 mm | Fine Science Tools | 11106-09 | |
| ring forceps 2.2/ 3 mm | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Adson Forceps-Serrated Straight 12 cm | Fine Science Tools | 1106-12 | |
| IrisScissors-Delicate Straight-Sharp/Blunt 10 cm | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Mayo-Stille Scissors-Straight 15 cm | Fine Science Tools | 14012-15 | |
| Dumont #5 Forceps-Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Castroviejo NeedleHolder-with Lock-Tungsten Carbide 14 cm | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Elektroporator CUY21 SC | Nepa Gene Co. | ||
| FST 250 Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Microgrinder EG-44 | Narishige | ||
| P-97 Micropette Puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Platinum electrodes 650P 0.5 mm | Nepagene | CUY650P0.5 | |
| Platinum electrodes 650P 3 mm | Nepagene | CUY650P3 | |
| Platinum electrodes 650P 5 mm | Nepagene | CUY650P5 | |
| Platinum electrodes 650P 10 mm | Nepagene | CUY650P10 | |
| Anesthesia system | Rothacher-Medical GmbH | CV-30511-3 Vapor 19.3 | |
| Heating plate | Rothacher-Medical GmbH | HP-1M | |
| Temperature Controller 220V AC | Rothacher-Medical GmbH | TCAT-2LV |
Referências
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