We demonstrate a method for grafting cultured cells into defined sites of early mouse embryos to determine their in vivo potential. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing the precise delivery of exogenous DNA into a few cells in the embryos.
Manipulation og kultur af tidlige museembryoer er en kraftfuld høj grad underudnyttet teknologi øge værdien af denne model system. Omvendt er cellekultur været meget anvendt i udviklingsmæssige biologiske undersøgelser. Men det er vigtigt at fastslå, om in vitro dyrkede celler virkelig repræsentere in vivo celletyper. Podning celler i embryoner, efterfulgt af en vurdering af deres bidrag under udviklingen er en nyttig metode til at bestemme potentialet af in vitro dyrkede celler. I denne undersøgelse, beskriver vi en fremgangsmåde til podning af celler i et defineret sted af tidlig implantation musefostre, efterfulgt af ex vivo kultur. Vi introducerer også en optimeret elektroporation metode, der bruger glaskapillarer med kendt diameter, gør det muligt præcist lokalisering og justering af antallet af celler, der modtager eksogent DNA med både høj transfektionseffektivitet og lav celledød. Disse teknikker, som ikke kræver nogen specialized udstyr, gøre eksperimentelle manipulationer af gastrulation og tidlig organogenese-fase museembryo muligt, således at en analyse af tilsagn i dyrkede celle subpopulationer og virkningen af genetiske manipulationer in situ på celledifferentiering.
Cellekultur har været meget anvendt i udviklingsmæssige biologiske undersøgelser. Mus embryonale stamceller (EKSF) og epiblasten stamceller (EpiSCs) kan differentiere sig til alle tre kim lag in vitro og er en nyttig model til celledifferentiering i begyndelsen pattedyr embryogenese. Udledningen af disse cellelinjer har åbnet en mulighed for in vitro-manipulation og detaljeret undersøgelse af de lokaliserede signalering arrangementer og transkriptionelle netværk, der opererer i den tidlige embryonale mønster. Men det er stadig vigtigt at bestemme de vivo relevansen af eventuelle manipulationer udføres i kultur. In vivo potentiale præimplantations embryo-afledt mus økonomiske og sociale råd er blevet vurderet ved at introducere dem tilbage til præimplantations embryoner (morulae eller blastocyster) 1. Dog kan EpiSCs der repræsenterer epiblasten celler i implantation embryoer ikke integrere effektivt i præimplantations embryoner 2,3. Vores previoos fund har vist, at EpiSCs effektivt kan generere kimærer og bidrage til alle kim lag, når de er podet ind implantation embryoner 4. Således er den bedste måde at evaluere in vitro dyrkede celler er at introducere dem til deres tilsvarende miljø in vivo.
Elektroporation er en udbredt metode til at levere exogene molekyler i målcellerne i både in vivo og in vitro forsøg. Elektrisk energi kan generere et stort antal porer i cellemembranen, som tillader exogen deoxyribonukleinsyre (DNA) eller ribonukleinsyre (RNA) til ind i cellerne. En af de største udfordringer for denne teknik er at kombinere optimal levedygtighed celle med høj electrotransfection virkningsgrad 5,6. For elektroporation af nukleinsyrer i embryoniske væv, forgyldt elektroder har mest almindeligt blevet anvendt, tillader målretning af celler i en bred vifte rumlig 7-9. For at opnå en mere localized genoverførsel har en nål elektrode blevet anvendt til at opnå et samlingspunkt elektrisk felt 10,11. Ved hjælp af denne fremgangsmåde, viste, at efter elektroporering, havde omkring 30-60 celler optages DNA-konstruktionen 11 forfatterne. Det forekommer dog, at præcist at justere antallet af elektroporerede celler stadig vanskeligt med en fast bredde elektrode. Kapillarrøret elektroporering teknik har været anvendt til at levere plasmider til enkeltceller 12-14. Imidlertid har denne teknik ikke er anvendt til elektroporering plasmider for embryoner ex vivo. For nylig er en microdevice blevet rapporteret at lokalt elektroporere få distale viscerale endoderm celler (mindre end 4 celler) i begyndelsen af implantation musefostre 15. Det er dog stadig uvist, om denne enhed effektivt kan målrette ektoderm og mesoderm ex vivo.
I denne undersøgelse beskriver vi to nye metoder til vurdering cellulære og gen-funktion i begyndelsen af indlæg-implantation embryoner. Vi først vise, hvordan man kan pode in vitro dyrkede celler i bestemte steder i tidlige museembryoer at vurdere deres in vivo potentiale. Integrationen af de podede celler og deres efterkommere, alle mærket med en genetisk tag (f.eks et grønt fluorescerende protein (GFP), yderligere kan undersøges ved immunfarvning af vævsspecifikke proteiner 4. For det andet beskriver vi en forbedret metode til præcist at levere DNA til lokaliserede steder i embryoet via elektroporation. Snarere end at bruge en nål elektrode, vi har indsat en tynd tråd inde i en spids glaskapillar, og viser, at denne ændring kan levere DNA til et lille antal celler med høj effektivitet og begrænset celledød. Desuden viser vi, at ved at bruge glas kapillærer med forskellige åbning størrelser, kan vi kontrollere antallet af elektroporerede celler. Derfor mener vi, denne metode kan være til stor nytte at studere tidlige embryonale mønster involverer små tal of celler.
Podning
Det kritiske skridt for celle podning eksperimenter er indsættelsen af en sammenhængende streng af celler ideelt i en enkelt handling, for at undgå opsplitning af klump. Denne teknik kræver nogen øvelse i at kontrollere mundpipette. Hvis donorceller indarbejde godt i værten, vil deres derivater sprede i embryoet. For yderligere at fastslå, om de dispergerede donor-afledte celler differentierer hensigtsmæssigt i værten, kan immunfarvning udføres på embryo sektioner. Hvis donor celler er ikke kompatible med værten miljø, de enten ikke kan påvises (som de er fordrevet fra embryonet) eller danne personlige klumper i embryoner efter kultur. Hvis begge spredte celler og celleklumper blev observeret, kan det indikere, at alt for mange celler blev podet og overdrevne donor celler, der ikke kan interagere med omgivende værtsceller resulterede i klump formation. I dette tilfælde yderligere transplantater indeholdendeet mindre antal celler kan udføres.
Den største begrænsning af cellen podning teknik er, at det ikke er muligt at bestemme det fulde potentiale in vivo af celler, eftersom muse ex vivo kultur i perioder længere end 48 timer er ikke blevet opnået. Men hvis de kombineres med ultralydsvejledt celleinjektion, kan det være muligt at overføre dyrkede celler til embryoner i livmoderen. For at opsummere, celle podning eksperimenter er ofte blevet brugt i vores gruppe, og har givet os værdifulde fingerpeg om de vivo potentiale af forskellige celletyper 4,21,22. Det er en teknik til generel anvendelighed til at vurdere in vivo potentiale in vitro dyrkede celler i tidlig implantation embryoer.
Elektroporering
Selv om der i denne undersøgelse har vi kun vist, at det er effektivt at anvende kapillære elektroporationsteknik at målrette epiblasten, it er også muligt at målrette forsætligt andre kim lag såsom endoderm celler. Det kritiske skridt for kapillære elektroporation teknik er at minimere den tid, det tager at elektroporere hvert embryo (<5 min pr embryo), da PBS er meget suboptimal for tidlige museembryoner. Vores data ovenfor har vist, at i de fleste områder i embryoner, er elektroporation ikke påvirke væksten fosteret. Men elektroporation i knudepunktet forårsagede unormal udvikling og førte til for tidlig død af embryoet. Dette vil sandsynligvis på grund af skader eller død af de celler, der danner vigtige signalering centre 23. Derfor ville denne region skal undgås med denne teknik. En yderligere undtagelse er, at som nævnt i resultatafsnittet, mens epiblasten eller primitive streak celler blev målrettet, nogle endoderm celler blev også elektroporeret. Det kan være, fordi DNA når til endoderm gennem huller under epiblasten epitel. Endoderm består af epitelceller og i vores erfaring thESE celler har en højere tilbøjelighed til at optage DNA. Derfor, når anvendelsen af denne teknik til skæbnen kortlægning, er det vigtigt at vurdere, hvilke celler indledningsvis tage op DNA.
Det skal også bemærkes, at skønt pCAG-GFP og pCAG-Cre: kan GFP-plasmider leveres effektivt ved hjælp af elektroporation parametre, der vises i denne undersøgelse, kan effektiviteten af andre DNA-konstruktioner variere, og behov for individuel optimering. Ændringer i DNA-koncentration, elektroporering spænding eller antallet af impulser kan ske, hvis plasmider viser sig at være vanskeligt at transficere.
For at opsummere, kan vores optimerede kapillar elektroporation systemet effektivt og reproducerbart levere GFP eller Cre: GFP plasmider i en meget få celler i embryonet med begrænset celledød. Da denne metode ikke kræver dyrt eller højt specialiseret udstyr, kan det være til stor nytte for cellesporing undersøgelser eller i at teste virkningen af ektopisk ekspression eller betinget deletion of gener i tidlige embryoner, er, hvis elektroporation udført i embryoner med floxet betingede mutantalleler. Derfor er denne elektroporationsteknik giver et nyttigt funktionel redskab til at forstå på en celle til celle-basis roller celle-intrinsisk faktorer i forbindelse med lokaliseret vildtype embryonale miljøer.
The authors have nothing to disclose.
We thank Filip Wymeersch and Anestis Tsakiridis for comments on the manuscript, staff in the SCRM animal unit for help with animal maintenance and Prof. Stuart Forbes for immunohistochemistry reagents. This work was supported by MRC grant Mr/K011200/1 and the China Scholarship Council
Forceps | Dumostar | T5390 | |
Dissecting stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
Stereomicroscope system with fluorescence | Nikon | AZ100 | |
Inverted microscope with a digital camera | Olympus | Olympus BX61 | |
Inverted confocal microscope | Leica Microsystems | Leica TCS SP8 | |
Low melting point agarose | Life Technologies | 16520-050 | |
Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 11397863 | |
30mm Petri dishes | Fisher Scientific | 121V | |
4-well plates | Thermo scientific | 179820 | |
M2 medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 10010015 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Pipettes | NICHIRYO | Nichipet | |
tips | Greiner Bio One | 685280 | |
Cell culture incubator | SANYO | MCO-17AIC | |
Roller culture apparatus | BTC Engineering | ||
Syringe filters 0.45µm, sterile | Sigma-Aldrich | 10462100 | |
Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM) | Sigma-Aldrich | G5154 | |
non-essential amino acids (NEAA) | Life Technologies | 11140050 | |
L-glutamine | Fisher Scientific | SH30549.01 | |
Sodium pyruvate solution | Fisher Scientific | SH30239.01 | |
Penicillin and Streptomycin 10.000UI/ml | Lonza | DE17-602E | |
Gas Cartridge for Portable Meker Burner | COLEMAN | COLEMAN 250 | |
Thin Wall Borosilicate Capillary Glass with Fillament, OD 1.0 mm, ID 0.78 mm | Harvard Apparatus | 640798 | |
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
Microforge | De Fonbrune | BS030301 | |
Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | PV830 | |
Microloader tips | Eppendorf | 5242956.003 | |
ECM 830 square wave pulse generator | BTX | 45-0002 | |
Green food coloring dye | Sigma-Aldrich | C.I. 42053 | |
A far-red cell membrane-impermeable nuclear dye | Biotium | 40060-T | |
pCAG-Cre:GFP | Addgene | #13776 | |
pCAG-GFP | Addgene | #16664 | |
Multimeter | Excel | XL830L | |
Micromanipulators | Leitz | ||
0.2mm diameter platinum wire | Agar Scientific | E404-2 | |
Anti-GFP antibody | Abcam | ab13970 | |
Goat anti-Chicken IgY, HRP | Santa Cruz | sc-2428 | |
Liquid DAB+ Substrate Chromogen System | Dako | K3467 | |
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D21490 | |
A far-red fluorescence nuclear counterstain | Life Technologies | T3605 |