För att till fullo förstå hur nervceller kommunicerar i hjärnan, är det nödvändigt att ha en metod för att mäta frisättningen av signalsubstanser in vivo. Det finns flera väletablerade metoder för att mäta signalsubstanser in vivo. En vanligen använd teknik är mikrodialys, i vilket en kanyl införes in i hjärnan och en liten volym av cerebrospinalvätska uppsamlas och analyseras med användning av HPLC och elektrokemisk detektion ^1. Mikrodialys har en rumslig upplösning av storleksordningen några få diametrar av sonden, t.ex., ~ 0,5 mm för en mikrosond 200 ^ m diameter. Den temporala upplösningen av denna teknik är emellertid långsamt på grund av provtagningsintervall som vanligtvis varar ~ 5 min eller längre ^en. Dessutom är analyser inte görs i realtid. En annan teknik är snabb scanning cyklisk voltametri (FSCV), som använder en kolfiber sond som sätts in i hjärnan. FSCV har utmärkt temporal upplösning (subsecond), hög känslighet (nanomolar) och spatial upplösning med sond diametrar av 5 till 30 ^ m. Dock är FSCV begränsad till sändare som producerar en karakteristisk oxidation och reduktion profil med spänning på ett kol potentiometrisk prob ^2.

En tredje teknik för att mäta signalsubstanser är direkt genom genetiskt kodad neurotransmittor (NT) biosensorer ^3. Med denna metod, är ett fusionsprotein som skapats som innehåller en ligand-bindande domän för en sändare som är kopplad till en fluorescensresonansenergiöverföring (FRET) -baserad par av fluoroforer ⁴ eller en permuterade GFP ^5. Till skillnad från de två föregående metoderna är dessa biosensorer genetiskt kodas och uttryckas på ytan av en värdcell, såsom en neuron, genom produktionen av transgena djur eller akut med användningen av virala medel för att infektera celler. Hittills har genetiskt kodade biosensorer har endast utvecklats för detecting glutamat och GABA ^3-5. Begränsningar med dessa tekniker har varit den låga känsligheten, i nM-området, och oförmågan att expandera detekteringen till det stora antal sändare, t.ex. klassiska neurotransmittorer, neuropeptider och neuromodulatorer, som signalerar genom G-proteinkopplade receptorer (GPCR). I själva verket finns det nästan 800 GPCR i det mänskliga genomet.

För att åtgärda dessa brister, har vi utvecklat ett innovativt verktyg för att optiskt mått frisättning av någon signalsubstans som signalerar genom en GPCR. CNiFERs (cellbaserad signalsubstans fluorescerande manipulerade reportrar) är klonala HEK293-celler manipulerade för att uttrycka en specifik GPCR som, när de stimuleras, utlöser en ökning av intracellulär [Ca2 ^+] som detekteras av en genetiskt kodad FRET-baserade Ca2 ⁺ sensor, TN-XXL. Sålunda CNiFERs omvandla neurotransmittorreceptorbindning in i en förändring i fluorescens, vilket ger en direkt och i realtid optiska read-slut lokal neurotransmittoraktivitet. Genom att utnyttja den nativa receptorn för ett givet neurotransmittor, CNiFERs behålla den kemiska specificitet, affinitet och tidsmässig dynamik hos de endogent uttryckta receptorer. Till dags dato har vi skapat tre typer av CNiFERs, en för detektering av acetylkolin med hjälp av M1-receptorn, en för att detektera dopamin med hjälp av D2-receptorn, och ett för att detektera noradrenalin med hjälp av a1a receptor ^6,7. Den CNiFER tekniken är lätt expanderbar och skalbar, vilket gör det mottagligt för någon typ av GPCR. I detta JUPITER artikeln beskriver vi och illustrerar metoden att utforma, förverkliga och testa in vivo CNiFERs för alla program.