Biz hacimsel nörotransmitter salınımı optik tespiti için hücre tabanlı nörotransmiter floresan mühendislik gazetecilere (CNiFERs) oluşturmak için bir protokol mevcut.
Hücre bazlı nörotransmiter floresan mühendislik gazetecilere (CNiFERs) Nörobilimadamları optik in vivo beyinde nörotransmitterlerin salınımını tespit etmek için yeni bir araç sağlar. Belirli CNiFER sabit şekilde belirli bir G protein-eşli reseptörü, G q Çift / 11 G proteinleri ve bir oyma göre Ca2 + -detector, TN-XXL eksprese eden bir insan embriyonik böbrek hücre oluşturulur. reseptörünün aktivasyonu FRET sinyali bir artışa yol açar. Bir CNiFER klonu dopamin için D2R, örneğin, belirli bir nörotransmitter için yerel reseptörünü kullanır, çünkü CNiFERs nM duyarlılık ve saniye zamansal tepki var. CNiFERs doğrudan beyne implante in vivo hacim iletimi ölçmek için idealdir, daha az yüz mikron mekansal çözünürlükte nörotransmitter salınımını anlamda sağlayarak vardır. CNiFERs da vi olası çapraz reaktivite için diğer ilaçları taramak için kullanılabilirvo. Biz son zamanlarda GPCRs G i / o G proteinleri bu çift eklemek için CNiFERs ailesi genişledi. CNiFERs asetilkolin (ACh), dopamin (DA) ve norepinefrin (NE) tespit edilmesi için kullanılabilir. Herhangi bir GPCR CNiFER bir roman oluşturmak için kullanılabilir göz önüne alındığında yaklaşık insan genomunda 800 GPCR'ler olduğunu tasarlar, gerçekleştirmek ve CNiFER her türlü test etmek için buraya genel prosedürü açıklar.
Tam nöronlar beyinde nasıl iletişim anlamak için, in vivo nörotransmitterlerin salınımını ölçmek için bir yöntem olması gereklidir. In vivo olarak nörotransmitter ölçmek için çeşitli iyi bilinen teknikler vardır. Genel olarak kullanılan bir teknik, bir kanül, beyin içine yerleştirilir ve beyin omurilik sıvısı, küçük bir hacme ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi ve elektrokimyasal algılama 1 kullanılarak analiz edildiği mikrodiyaliz vardır. Mikrodiyaliz sondası birkaç çapları düzeyinde bir uzaysal çözünürlüğü, örneğin ~ 200 mikron çapında mikroprob 0.5 mm. Bu tekniğin zamansal çözünürlüğü, Bununla birlikte, tipik olarak ~ 5 dakika 1 ya da daha uzun süre örnekleme aralıkları yavaştır. Ayrıca, analizler gerçek zamanlı olarak yapılmaz. Başka bir teknik beyin içine yerleştirilen bir karbon-fiber prob kullanır hızlı tarama döngüsel voltametri (FSCV) 'dir. FSCV mükemmel temp vardırOral çözünürlük (subsecond), yüksek hassasiyet (nanomolar), ve 30 mikron 5 prob çapları uzamsal çözünürlük. Bununla birlikte, FSCV bir karbon potansiyometrik prob 2 gerilimi ile tipik bir oksidasyon ve redüksiyon profili üretmek vericiler ile sınırlıdır.
Nörotransmitterlerin ölçmek için üçüncü bir teknik genetik olarak kodlanmış nörotransmitter (NT) biyosensörler 3 ile doğrudan. Bu yöntemde, bir füzyon proteini, bir flüoresan rezonans enerji transferi (FRET) fluorophores 4 merkezli bir çift ya da sırası değiştirilerek GFP 5 bağlanmış bir verici için bir ligand bağlayıcı etki alanı içeren oluşturulur. Önceki iki yöntemlerden farklı olarak, bu biyosensörler genetik olarak kodlanmış ve transgenik hayvanların üretimi yoluyla veya akut hücreleri enfekte viral ajanların kullanımı ile, örneğin, bir nöron olarak, bir konak hücrenin yüzeyi üzerinde ifade edilmiştir. Bugüne kadar, genetik olarak kodlanmış biyosensörler yalnızca algılama gibi geliştirilmiştirg glutamat GABA 3-5. Bu teknikler ile sınırlamalar nM aralığında düşük hassasiyet, ve G-protein bağlı reseptör (GPCR) aracılığıyla sinyal örneğin vericiler, klasik nörotransmitterler, nöropeptitler ve nöromodülatör, çok sayıda algılama genişletmek yetersizlik olmuştur. Aslında, insan genomunda yaklaşık 800 GPCR'ler vardır.
Bu eksiklikleri gidermek için, biz bir GPCR aracılığıyla sinyal herhangi nörotransmiter optik ölçüsü serbest bırakmak için yenilikçi bir araç geliştirdik. CNiFERs (hücre bazlı nörotransmiter flüoresan tasarlanmış muhabir), uyarıldığında, [Ca2 +] bir genetik olarak kodlanmış FRET göre Ca2 + sensörü tarafından tespit edilir hücre içi bir artış tetikleyen belirli bir GPCR ifade etmek üzere geliştirilen klonal HEK 293 hücreleri TN-XXL. Bu nedenle, CNiFERs nörotransmiter reseptörü floresansında bir değişiklik olarak bağlanan bir doğrudan ve gerçek zamanlı bir optik r temin dönüşümüYerel nörotransmitter faaliyet ead-out. Belirli bir nörotransmitter doğal reseptörü kullanılarak, CNiFERs kimyasal özgüllük, afinite ve endogen şekilde eksprese reseptörlerin zamansal dinamikleri saklayın. Bugüne kadar, CNiFERs üç tip dopamin tespit etmek için M1 reseptörü, tek kullanılarak asetilkolin saptanması için bir oluşturduk D2 reseptörü kullanılarak ve α1a reseptör 6,7 ile norepinefrin saptanması için bir. CNiFER teknolojisi GPCR her tür o mükellef hale kolayca genişletilebilir ve ölçeklenebilir. Bu vallahi yazıda tarif ve herhangi bir uygulama için in vivo CNiFERs olarak, tasarım gerçekleştirmek için metodoloji ve testi göstermektedir.
CNiFERs yaratılması optik in vivo beyinde nörotransmitterlerin salınımını ölçmek için yenilikçi ve benzersiz bir strateji sağlar. CNiFERs ideal nörotransmitterlerin için yani extrasynaptic açıklaması, hacim iletimi, ölçmek için uygundur. Önemli olarak, her bir CNiFER beyinde nörotransmitter seviyelerindeki değişikliklerin fizyolojik optik ölçüm sağlayan doğal GPCR özelliklerine sahiptir. Bugüne kadar, CNiFERs asetilkolin tespit etmek için oluşturulmuştur (M + -1-CNiFER…
The authors have nothing to disclose.
Biz elektronik ile ilgili yardım için G qi5 ve G qs5 cDNA'ları, A. Schweitzer sağlamak için B. Conklin (University of California, San Francisco) teşekkür ederim, N. Taylor geçirmez okuma klonlar, Ian Glaaser ve Robert Rifkin tarama ile yardım için ve TN-XXL Olivier Griesbeck. (; DA037170 DA029706), Biyomedikal Görüntüleme ve Biyomühendislik Ulusal Enstitüsü (NIBIB) (EB003832), Hoffman-La Roche (88610A) ve "Neuroscience Bu çalışma Uyuşturucu ABD Ulusal Enstitüsü (NIDA) aracılığıyla araştırma hibeleri tarafından desteklenen NIDA (DA007315) üzerinden Kötüye "eğitim hibe Uyuşturucu ile İlgili.
pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro | System Biosciences | CD510B-1 | Cloning: for generating lentivirus |
12×75 *BD Falcon High Clarity Polypropylene Round Bottom Test Tube | BD Biosciences | 352063 | FACS |
BD 40 um Falcon cell strainers | BD Biosciences | 352340 | FACS |
0.05% Trypsin EDTA | Invitrogen | 25200056 | FACS |
96 Well Plate, flat bottom, clear | Corning | 3596 | FACS |
96 well cell culture plates | Corning | CLS3997 | Flexstation |
Optilux black clear bottom | Corning | 3603 | Flexstation |
Flexstation pipet tips | Molecular Devices | 9000-0911 | Flexstation |
Acetylcholine Chloride | SimgaAldrich | A2661 | Flexstation |
Norepinephrine | SimgaAldrich | A7256 | Flexstation |
Dopamine Hydrochloride | SimgaAldrich | PHR1090 | Flexstation |
GABA | SimgaAldrich | A2129 | Flexstation |
Histamine | SimgaAldrich | H7125 | Flexstation |
Glutamate | SimgaAldrich | 49621 | Flexstation |
Epinephrine | SimgaAldrich | E4642 | Flexstation |
Somatostatin | SimgaAldrich | S1763 | Flexstation |
5HT | SimgaAldrich | H9523 | Flexstation |
VIP | Alpha Diagnostics Inc. | SP-69627 | Flexstation |
Orexin A | Alpha Diagnostics Inc. | 12-p-01 | Flexstation |
Substance P | SimgaAldrich | S6883 | Flexstation |
Adenosine | SimgaAldrich | A4036 | Flexstation |
Melatonin | SimgaAldrich | M5250C | Flexstation |
Fluorescence Plate Reader & software | Molecular Devices | Flexstation 3 | Flexstation |
DMEM (high glucose) with Glutamax | Life Technologies | 10569-010 | Tissue culture |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082-139 | Tissue culture |
Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Tissue culture |
Puromycin | InvivoGen | ant-pr-1 | Tissue culture |
Fibronectin | SimgaAldrich | F0895 | Tissue culture |
CoolCell LX Alcohol-free controlled-rate cell freezing box | Bioexpress | D-3508) | Tissue culture |
cyanoacrylate glue | Loctite | Loctite no. 495 | surgery and stereotaxic injection |
plastic paraffin film | VWR | Parafilm® | surgery and stereotaxic injection |
NANOINJECTOR | Drummond | 3-000-204 | surgery and stereotaxic injection |
GLASS ELECTRODES | Drummond | 3-000-203G | surgery and stereotaxic injection |
hand held drill | OSADA | Exl-M40 | surgery and stereotaxic injection |
Burrs for drill | Fine Scientific | 19007-05; 19007-07) | surgery and stereotaxic injection |
Sterilizing bath | FST | 18000-45, Hot Bead Sterilizer | surgery and stereotaxic injection |
isoflurane chamber/mask | Highland Medical Equipment | 564-0427, HME 109 Table Top Anesthetic Machine with Isoflurane Vaporizer, O2 Flowmeter, Gang Valve; 564-0852, Induction Chamber 16X7X7.5cm | surgery and stereotaxic injection |
3D scope with arm | Zeiss | surgery and stereotaxic injection | |
fiber optic light | surgery and stereotaxic injection | ||
Betadine | surgery and stereotaxic injection | ||
70 % (v/v) isopropyl alcohol | surgery and stereotaxic injection | ||
Povidone-Iodine Prep Pads | dynarex | 1108 | surgery and stereotaxic injection |
NaCl 0.9% (INJECTION, USP, 918610) | surgery and stereotaxic injection | ||
CYCLOSPORINE (INJECTION, USP) | surgery and stereotaxic injection | ||
Buprenex (INJECTION) buprenorphine (0.03 μg per g rodent) | Sigma | surgery and stereotaxic injection | |
Ophthalmic ointment | Akorn | NDC 17478-235-35 | surgery and stereotaxic injection |
Surgifoam | Ethicon | surgery and stereotaxic injection | |
Grip dental cement | Dentsply | #675571, 675572 | surgery and stereotaxic injection |
Instant SuperGlue | NDindustries | surgery and stereotaxic injection | |
LOCTITE 4041 | surgery and stereotaxic injection | ||
METABOND | C&B | surgery and stereotaxic injection | |
no. 0 cover glass | Fisher | surgery and stereotaxic injection | |
stereotaxic frame | Kopf | surgery and stereotaxic injection | |
Rectal probe and heating pad | FHC | 40-90-8D, DC Temperature Controller,40-90-2-06, 6.5X9.5cm Heating Pad40-90-5D-02, Rectal Thermistor Probe | surgery and stereotaxic injection |
optical breadboard for imaging | Thorlabs | surgery and stereotaxic injection | |
Mineral oil | Fisher | S55667 | surgery and stereotaxic injection |
Kwik-Cast (Silicone elastomer) | World Precision Instruments | surgery and stereotaxic injection | |
Suture | Ethicon | 18’’, 1667, 4-0 | surgery and stereotaxic injection |
Scissors | Fine Scientific Tools | 91500-09, 15018-10 | surgery and stereotaxic injection |
Forcepts | Fine Scientific Tools | 11252-30; #55, 11295-51; Grafe, 11050-10 | surgery and stereotaxic injection |
Student Halsted-Mosquito Hemostats | Fine Scientific Tools | 91308-12 | surgery and stereotaxic injection |
Small Vessel Cauterizer Kit | Fine Scientific Tools | 18000-00 | surgery and stereotaxic injection |
Hot Bead Sterilizers | Fine Scientific Tools | 18000-45 | surgery and stereotaxic injection |
Instrument Case with Silicone Mat | Fine Scientific Tools | 20311-21 | surgery and stereotaxic injection |
Plastic Sterilization Containers with Silicone Mat | Fine Scientific Tools | 20810-01 | surgery and stereotaxic injection |
2P fixed-stage fluorescence scope for in vivo imaging | Olympus | FV1200 MPE | in vivo imaging |
Multiphoton laser | SpectraPhysics | Mai Tai DeepSee | in vivo imaging |
Green Laser | Olympus | 473 nm Laser | in vivo imaging |
xy translation base | Scientifica | MMBP | in vivo imaging |
FRET filter cube for YFP and CFP | Olympus | in vivo imaging | |
25-X water immersion objective | Olympus | in vivo imaging | |
air table | Newport | in vivo imaging | |
custom built light-tight cage | Thorlab | in vivo imaging |