Para comprender completamente cómo se comunican las neuronas en el cerebro, es necesario disponer de un método para medir la liberación de neurotransmisores en vivo. Existen varias técnicas bien establecidas para la medición de los neurotransmisores en vivo. Una técnica comúnmente usada es de microdiálisis, en el que se inserta una cánula en el cerebro y un pequeño volumen de líquido cefalorraquídeo se recoge y se analizó mediante cromatografía líquida de alto rendimiento y detección electroquímica ^1. La microdiálisis tiene una resolución espacial del orden de unos pocos diámetros de la sonda, por ejemplo, ~ 0,5 mm para una microsonda de 200 m de diámetro. La resolución temporal de esta técnica, sin embargo, es lento debido a los intervalos de muestreo que típicamente duran ~ 5 min o más ^1. Por otra parte, los análisis no se realizan en tiempo real. Otra técnica es escaneado rápido voltametría cíclica (FSCV), que utiliza una sonda de fibra de carbono que se inserta en el cerebro. FSCV tiene una excelente tempresolución por vía oral (por debajo del segundo), alta sensibilidad (nanomolar), y la resolución espacial con diámetro de la sonda de 5 a 30 micras. Sin embargo, FSCV está limitada a los transmisores que producen una oxidación característica y el perfil de reducción con el voltaje en una sonda potenciométrica de carbono ^2.

Una tercera técnica para medir los neurotransmisores es directamente a través de neurotransmisores codificado genéticamente biosensores (NT) ^3. Con este método, se crea una proteína de fusión que contiene un dominio de unión a ligando para un transmisor acoplado a una transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) par de fluoróforos con base ⁴ o una GFP permutado ^5. A diferencia de los dos métodos anteriores, estos biosensores están genéticamente codificados y expresados ​​en la superficie de una célula huésped, tal como una neurona, a través de la producción de animales transgénicos o de forma aguda con el uso de agentes virales para infectar las células. Hasta la fecha, los biosensores codificados genéticamente sólo se han desarrollado para detecting glutamato y GABA ^3-5. Limitaciones con estas técnicas han sido la baja sensibilidad, en el rango nM, y la incapacidad para ampliar la detección al gran número de transmisores, por ejemplo, neurotransmisores clásicos, neuropéptidos y neuromoduladores, que señalan a través de receptores acoplados a proteínas G (GPCRs). De hecho, hay cerca de 800 GPCRs en el genoma humano.

Para hacer frente a estas deficiencias, hemos desarrollado una herramienta innovadora para la liberación medida ópticamente de cualquier neurotransmisor que las señales a través de un GPCR. (Reporteros ingeniería neurotransmisor fluorescentes basado en células) CNiFERs son células HEK293 clonales ingeniería genética para expresar un GPCR específico que, cuando se estimula, provoca un aumento de intracelular [Ca ^{2 +]} que es detectada por un sensor ^de Ca2 ⁺ a base de FRET codificado genéticamente, TN-XXL. Por lo tanto, CNiFERs transformada de unión en un cambio en la fluorescencia, proporcionando un r óptica en tiempo real directa y receptor neurotransmisoread de salida de la actividad del neurotransmisor local. Mediante la utilización del receptor nativo para un neurotransmisor determinado, CNiFERs retienen la especificidad química, la afinidad y la dinámica temporal de los receptores expresados ​​de forma endógena. Hasta la fecha, hemos creado tres tipos de CNiFERs, una para la detección de la acetilcolina mediante el receptor M1, uno para la detección de la dopamina usando el receptor D2, y uno para la detección de norepinefrina mediante el ^6,7 receptor a1a. La tecnología CNiFER es fácilmente ampliable y escalable, por lo que es susceptible de cualquier tipo de GPCR. En este artículo JoVe, describimos e ilustramos la metodología para diseñar, realizar, y la prueba en vivo CNiFERs para cualquier aplicación.