Для того, чтобы полностью понять , как нейроны общаются в головном мозге, необходимо иметь метод измерения высвобождение нейротрансмиттеров в естественных условиях. Есть несколько хорошо зарекомендовавшие себя методы измерения нейротрансмиттеров в естественных условиях. Одно из наиболее часто используемым методом является микродиализ, в котором полая игла вставлена ​​в мозг и небольшой объем цереброспинальной жидкости собирают и анализируют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимическим детектированием и ^1. Микродиализ имеет пространственное разрешение порядка нескольких диаметров зонда, например, ~ 0,5 мм для зондового диаметром 200 мкм. Временное разрешение этого метода, однако, является медленным из – за интервалами между измерениями , которые обычно длятся ~ 5 минут или дольше ^1. Кроме того, анализы не производятся в режиме реального времени. Другой метод является быстрое сканирование циклической вольтамперометрии (FSCV), которая использует углеродного волокна зонд, который вставляют в мозг. FSCV имеет отличную темпоральная разрешение (субсекундных), высокая чувствительность (нмоль) и пространственное разрешение с зондами диаметром от 5 до 30 мкм. Тем не менее, FSCV ограничивается передатчиками , которые производят характерное окисление и профиль снижения питание подано на потенциометрического датчика углерода ^2.

Третий способ для измерения нейротрансмиттеры непосредственно через генетически закодированы нейромедиаторов (NT) биосенсоров ^3. С помощью этого метода, слитый белок создается , который содержит лиганд-связывающий домен для передатчика , соединенного с флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) основе пары флуорофоров ⁴ или перестановкой GFP ^5. В отличие от предыдущих двух методов, эти биосенсоры генетически закодированы и экспрессируется на поверхности клетки-хозяина, такой как нейрон, через получения трансгенных животных или остро с использованием вирусных агентов, чтобы инфицировать клетки. На сегодняшний день генетически кодируемые биосенсоры были разработаны только для detectinг глутамата и ГАМК ^3-5. Ограничения с помощью этих методик были низкая чувствительность, в диапазоне нМ, и невозможность расширить обнаружения для большого числа передатчиков, например, классических нейромедиаторов, нейропептидов и нейромодуляторов, которые передают сигналы посредством G-белками (GPCR , ). На самом деле, существует около 800 GPCRs в геноме человека.

Для устранения этих недостатков, мы разработали инновационный инструмент для оптического высвобождения мера любого нейротрансмиттера, который сигнализирует через GPCR. CNiFERs ( на основе клеток нейромедиатором флуоресцентных сконструированные репортеры) являются клоновых клетки НЕК293 , сконструированные для экспрессии конкретного GPCR , что при стимуляции, вызывает увеличение внутриклеточного [Са ^2+] , который определяется генетически кодируемой FRET основе датчика Ca ^2+, TN-XXL. Таким образом, преобразование CNiFERs нейромедиатора связывание рецептора в изменение флуоресценции, что обеспечивает оптическую р прямой и в режиме реального времениСвинец-из местной активности нейромедиаторов. Используя нативный рецептор для данного нейромедиатора, CNiFERs сохраняют химическую специфичность, сродство и временной динамики эндогенно выраженных рецепторов. На сегодняшний день мы создали три типа CNiFERs, один для обнаружения ацетилхолин с помощью рецептора M1, один для обнаружения допамина используя рецептор D2, и один для обнаружения норадреналина с использованием ^6,7 – рецептора α1a. Технология CNiFER легко расширяемая и масштабируемая, что делает его доступным для любого типа GPCR. В этой статье Jove, мы опишем и проиллюстрировать методологию разработки, реализации и испытания в естественных условиях CNiFERs для любого применения.