Para entender completamente como os neurônios se comunicam no cérebro, é necessário ter um método para medir a liberação de neurotransmissores in vivo. Existem várias técnicas bem estabelecidas para a medição in vivo neurotransmissores. Uma técnica utilizada é de microdiálise, em que uma cânula é inserida no cérebro e um pequeno volume de fluido cerebrospinal são recolhidas e analisadas por cromatografia líquida de elevado desempenho e detecção electroquímica ^1. Microdiálise tem uma resolução espacial na ordem de alguns diâmetros da sonda, por exemplo, ~ 0,5 mm para uma microssonda de 200 um de diâmetro. A resolução temporal desta técnica, no entanto, é lento devido a intervalos de amostragem que duram tipicamente ~ 5 minutos ou mais ^1. Além disso, as análises não são feitos em tempo real. Uma outra técnica é a pesquisa rápida voltametria cíclica (FSCV), que usa uma sonda de fibra de carbono que é introduzido no cérebro. FSCV tem excelente Tempresolução oral (subsecond), de alta sensibilidade (nanomolar), e resolução espacial com o diâmetro da sonda de 5 a 30 um. No entanto, está limitado a FSCV transmissores, que produzem uma característica de oxidação e redução perfil com tensão em uma sonda potenciométrica de carbono ^2.

Uma terceira técnica para medir neurotransmissores é diretamente através de neurotransmissores geneticamente codificado (NT) biossensores ^3. Com este método, uma proteína de fusão é criada que contém um domínio de ligação ao ligando para um transmissor acoplado a uma transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) par com base na fluoróforos de ⁴ ou ⁵ permutado um GFP. Ao contrário dos dois métodos anteriores, estes biossensores são geneticamente codificado e expresso na superfície de uma célula hospedeira, tal como um neurónio, através da produção de animais transgénicos ou de forma aguda com a utilização de agentes virais para infectar as células. Até à data, biossensores geneticamente codificados só foram desenvolvidos para detecting glutamato e GABA ^3-5. Limitações com estas técnicas têm sido a baixa sensibilidade, na gama nM, e a incapacidade para expandir a detecção de um grande número de emissores, por exemplo, neurotransmissores clássicos, neuropéptidos e neuromoduladores, que sinalizam através de receptores acoplados à proteína G (GPCRs). Na verdade, existem cerca de 800 GPCRs no genoma humano.

Para lidar com essas deficiências, desenvolvemos uma ferramenta inovadora para liberação medida opticamente de qualquer neurotransmissor que sinaliza através de um GPCR. CNiFERs (com base nas células repórteres fluorescentes modificadas neurotransmissor) são células HEK293 clonais manipuladas para expressar um GPCR específico que, quando estimulados, desencadeia um aumento na intracelular ^{[Ca2 +]} que é detectado por um sensor baseado em FRET de Ca ²⁺ geneticamente codificado, TN-XXL. Assim, obrigatório neurotransmissor CNiFERs transformar-se numa alteração na fluorescência, proporcionando uma óptica R em tempo real e directa do receptoread-out da actividade neurotransmissora local. Ao utilizar o receptor nativo para um determinado neurotransmissor, CNiFERs reter a especificidade química, afinidade e dinâmicas temporais dos receptores expresso endogenamente. Até à data, criámos três tipos de CNiFERs, um para detectar a acetilcolina utilizando o receptor M1, um para a detecção de dopamina utilizando o receptor D2, e um para detectar a norepinefrina usando o receptor de ^6,7 α1a. A tecnologia CNiFER é facilmente expansível e escalável, tornando-se passível de qualquer tipo de GPCR. Neste artigo Jove, que descrevem e ilustram a metodologia para conceber, realizar, e teste em CNiFERs vivo para qualquer aplicação.