Per comprendere appieno come i neuroni comunicano nel cervello, è necessario disporre di un metodo per misurare il rilascio di neurotrasmettitori in vivo. Ci sono diverse tecniche consolidate per la misurazione neurotrasmettitori in vivo. Una tecnica comunemente usata è microdialisi, in cui una cannula viene inserita nel cervello e un piccolo volume di liquido cerebrospinale viene raccolto ed analizzato mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni e rilevazione elettrochimica ^1. Microdialisi ha una risoluzione spaziale dell'ordine di pochi diametri della sonda, ad esempio, ~ 0,5 mm per una microsonda 200 micron di diametro. La risoluzione temporale di questa tecnica, tuttavia, è lento a causa di intervalli di campionamento che tipicamente durano ~ 5 minuti o più ^1. Inoltre, le analisi non sono fatti in tempo reale. Un'altra tecnica è scansione veloce voltammetria ciclica (FSCV), che utilizza una sonda in fibra di carbonio che viene inserito nel cervello. FSCV ha eccellenti temperaturaRisoluzione orale (in frazioni), alta sensibilità (nanomolari), e la risoluzione spaziale con diametri della sonda da 5 a 30 micron. Tuttavia, FSCV è limitato ai trasmettitori che producono ossidazione caratteristico profilo riduzione con tensione su una sonda potenziometrica carbonio ^2.

Una terza tecnica per misurare neurotrasmettitori è direttamente attraverso neurotrasmettitori geneticamente codificato biosensori (NT) ^3. Con questo metodo, una proteina di fusione viene creato che contiene un dominio ligando vincolante per un trasmettitore accoppiato ad un trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET) accoppiamento sede di fluorofori ⁴ o un GFP permutati ^5. A differenza delle precedenti due metodi, questi biosensori sono geneticamente codificati ed espressi sulla superficie di una cellula ospite, come un neurone, attraverso la produzione di animali transgenici o acutamente con l'uso di agenti virali per infettare le cellule. Fino ad oggi, biosensori geneticamente codificati sono stati sviluppati solo per detecting glutammato e GABA ^3-5. Limitazioni con queste tecniche sono la bassa sensibilità, nell'intervallo nM, e l'incapacità di espandere il rilevamento del gran numero di trasmettitori, ad esempio, neurotrasmettitori classici, neuropeptidi e neuromodulatori, che segnalano attraverso recettori accoppiati alla proteina G (GPCR). In realtà, ci sono quasi 800 GPCR nel genoma umano.

Per far fronte a queste carenze, abbiamo sviluppato uno strumento innovativo per misura rilascio otticamente di qualsiasi neurotrasmettitore che segnala attraverso un GPCR. CNiFERs (neurotrasmettitore fluorescenti a base di cellule reporter ingegnerizzati) sono cellule HEK293 clonali ingegnerizzate per esprimere un GPCR specifico che, quando stimolato, provoca un aumento intracellulare [Ca ^2+] che viene rilevata da un sensore geneticamente codificato FRET-based Ca ^2+, TN-XXL. Così, CNiFERs trasformare recettore neurotrasmettitore vincolante in un cambiamento della fluorescenza, fornendo un r ottica tempo reale diretta eead-out di attività neurotrasmettitore locale. Utilizzando il recettore nativo per un determinato neurotrasmettitore, CNiFERs conservano la specificità chimica, affinità e dinamiche temporali dei recettori endogenamente espressi. Ad oggi, abbiamo creato tre tipi di CNiFERs, uno per rilevare acetilcolina usando il recettore M1, uno per rilevare dopamina utilizzando il recettore D2, e uno per rilevare noradrenalina usando ^l'6,7 recettore tipo a1A. La tecnologia CNiFER è facilmente espandibile e scalabile, rendendolo suscettibile a qualsiasi tipo di GPCR. In questo articolo Giove, descriviamo e illustrare la metodologia per la progettazione, la realizzazione, e la prova CNiFERs vivo per qualsiasi applicazione.