בנייה מבוססת תאים נוירוטרנסמיטר פלורסנט Engineered כתבים (CNiFERs) עבור זיהוי אופטי של נוירוטרנסמיטורים<em> In vivo</em
Summary
אנו מציגים פרוטוקול ליצור לכתבים מהונדסים פלורסנט הנוירוטרנסמיטר מבוססי תאים (CNiFERs) לצורך זיהוי אופטי של שחרור הנוירוטרנסמיטר נפח.
Abstract
כתבים מהונדסים פלורסנט הנוירוטרנסמיטר מבוסס תאים (CNiFERs) לספק כלי חדש עבור מדעני מוח כדי אופטי לזהות את השחרור של נוירוטרנסמיטורים במוח in vivo. ספציפית CNiFER נוצר מתא כליה עוברי אנושי ביציבות מבטא G- חלבון בשילוב ספציפי לקולטן, אשר זוגות q G / 11 חלבוני G, וכן סריג מבוסס Ca 2+ -detector, TN-XXL. הפעלת הקולטן מובילה לעליית אות הסריג. CNiFERs יש ננומטר רגיש תגובה זמנית של שניות, כי שיבוט CNiFER מנצל את הקולטן המקורי עבור נוירוטרנסמיטר מסוים, למשל, D2R עבור דופמין. CNiFERs מושתל ישירות לתוך המוח, מה שמאפשר להם לחוש שחרור הנוירוטרנסמיטר עם רזולוציה מרחבית של פחות ממאה מיקרומטר, מה שהופך אותם אידיאליים כדי למדוד הולכת נפח in vivo. CNiFERs יכול גם לשמש מסך תרופות אחרות עבור תגובתיות צולבת הפוטנציאל viVO. לאחרונה הרחיבה משפחת CNiFERs לכלול GPCRs כי בני הזוג G i / o G חלבונים. CNiFERs זמין לאיתור אצטילכולין (ACH), דופמין (DA) ונוראפינפרין (NE). בהתחשב בכך כל יכול לשמש GPCR ליצור רומן CNiFER וכי ישנם כ 800 GPCRs בגנום האנושי, אנו מתארים כאן את ההליך באופן כללי לתכנן, להבין, ולבדוק כל סוג של CNiFER.
Introduction
כדי להבין כיצד נוירונים לתקשר במוח, יש צורך להיות שיטה למדוד את שחרורו של נוירוטרנסמיטורים in vivo. ישנן מספר ומבוסס טכניקות למדידת נוירוטרנסמיטורים in vivo. טכניקה נפוצה אחת היא microdialysis, שבו צינורית מוכנס לתוך מוח נפח קטן של נוזל השדרתי נאסף ונותח באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעל ביצועים גבוהים אלקטרוכימיים זיהוי 1. Microdialysis בעל רזולוציה מרחבית בסדר גודל של כמה בקטרים של החללית, למשל, ~ 0.5 מ"מ עבור microprobe בקוטר 200 מיקרומטר. ההחלטה הזמנית של טכניקה זו, לעומת זאת, הוא איטי בגלל מרווחי דגימה אשר בדרך הכלל האחרון ~ 5 דקות או יותר 1. יתר על כן, ניתוחים אינם עשויים בזמן אמת. טכניקה נוספת היא voltammetry המחזורית הסריקה מהירה (FSCV), אשר משתמשת במכשיר בדיקה סיבי פחמן מוכנס לתוך המוח. יש FSCV טמפ מעולהרזולוציה אוראלית (subsecond), רגישות גבוהה (nanomolar), ברזולוציה מרחבית בקטרי בדיקה של 5 עד 30 מיקרומטר. עם זאת, FSCV מוגבל משדרי המייצרים חמצון מאפיין ופרופיל הפחתה במתח על בדיקת פוטנציומטרית פחמן 2.
טכניקה שלישית למדוד נוירוטרנסמיטורים היא ישירות דרך הנוירוטרנסמיטר גנטי בקידוד (NT) biosensors 3. באמצעות שיטה זו, חלבון היתוך חדש שמכיל תחום מחייב ליגנד עבור משדר מצמיד את העברת אנרגית תהודת קרינה (סריג) זוג מבוסס של fluorophores 4 או permutated GFP 5. בניגוד לשתי השיטות הקודמות, חיישנים ביולוגיים אלה מקודדים גנטיים והביעו על פני השטח של תא מארח, כגון תא עצב, דרך הייצור של חיות טרנסגניות או בחריפות עם השימוש בחומרים ויראלי להדביק תאים. נכון להיום, biosensors גנטית בקידוד פותחו רק detectinגלוטמט g ו- GABA 3-5. מגבלות עם טכניקות אלה היו רגישים הנמוכים, בטווח ננומטר, וחוסר היכולת להרחיב את זיהוי המספר הגדול של משדרים, למשל, נוירוטרנסמיטורים קלסי, נוירופפטידים ו neuromodulators, אשר אות דרך החלבון בשילוב קולטנים G (GPCRs). למעשה, ישנם קרוב ל -800 GPCRs בגנום האנושי.
כדי לתת מענה הגירעונות הללו, פתחנו כלי חדשני לשחרורו מידה האופטי של כל נוירוטרנסמיטר סיגנלים דרך GPCR. CNiFERs (כתבים מהונדסים פלורסנט הנוירוטרנסמיטר מבוסס תאים) הם תאים משובטים HEK293 המהונדס להביע GPCR ספציפי, כאשר מגורה, מפעיל עלייה תאית [Ca 2 +] כי הוא זוהה על ידי חיישן סריג מבוסס מקודדים גנטיים Ca 2+, TN-XXL. לפיכך, CNiFERs להפוך קולטן הנוירוטרנסמיטר מחייב לכדי שינוי קרינה, מתן r האופטי ישירה בזמן האמתקצוב EAD של פעילות הנוירוטרנסמיטר מקומית. על ידי ניצול של קולטן המקורי עבור נוירוטרנסמיטר נתון, CNiFERs לשמר את וספציפיות כימיות, זיקה ודינמיקה זמנית של קולטנים הביע באופן אנדוגני. נכון להיום, יצרו לנו שלושה סוגים של CNiFERs, אחד לאיתור אצטילכולין באמצעות קולטן M1, אחד לאיתור דופמין באמצעות קולטן D2, ואחד לאיתור נוראפינפרין באמצעות 6,7 קולטן α1a. טכנולוגית CNiFER היא בקלות להרחבה, וניתן להרחבה, מה שהופך אותו מי שפתוח לכל סוג של GPCR. במאמר יופיטר זה נתאר ולהמחיש את המתודולוגיה לעצב, להבין, ובדקו CNiFERs vivo עבור כל יישום.
Protocol
Representative Results
Discussion
יצירת CNiFERs מספקת אסטרטגיה חדשנית וייחודית למדידה אופטית שחרור של נוירוטרנסמיטורים במוח in vivo. CNiFERs מותאם באופן אידיאלי למדידת שחרור extrasynaptic, כלומר, הולכת נפח, מסרים עצביים. חשוב לציין, כל CNiFER בעל המאפיינים של GPCR הילידים, מתן מדידה אופטית פיזיולוגית של השינויי?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ב קונקלין (אוניברסיטת קליפורניה, סן פרנסיסקו) למתן qi5 G ו- G qs5 cDNAs, א שווייצר לסיוע עם אלקטרוניקה, נ טיילור לסיוע עם הקרנת שיבוטים, איאן Glaaser ורוברט ריפקין לקריאה הוכחה , ואוליבייה Griesbeck עבור TN-XXL. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר באמצעות המוסד האמריקני הלאומי לשימוש בסמים (NIDA) (DA029706; DA037170), המכון הלאומי של הדמיה ביו Bioengineering (NIBIB) (EB003832), Hoffmann-La Roche (88610A) ו "Neuroscience הקשור לתרופות של מענק הכשרה לרעה "דרך NIDA (DA007315).
Materials
| pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro | System Biosciences | CD510B-1 | Cloning: for generating lentivirus |
| 12×75 *BD Falcon High Clarity Polypropylene Round Bottom Test Tube | BD Biosciences | 352063 | FACS |
| BD 40 um Falcon cell strainers | BD Biosciences | 352340 | FACS |
| 0.05% Trypsin EDTA | Invitrogen | 25200056 | FACS |
| 96 Well Plate, flat bottom, clear | Corning | 3596 | FACS |
| 96 well cell culture plates | Corning | CLS3997 | Flexstation |
| Optilux black clear bottom | Corning | 3603 | Flexstation |
| Flexstation pipet tips | Molecular Devices | 9000-0911 | Flexstation |
| Acetylcholine Chloride | SimgaAldrich | A2661 | Flexstation |
| Norepinephrine | SimgaAldrich | A7256 | Flexstation |
| Dopamine Hydrochloride | SimgaAldrich | PHR1090 | Flexstation |
| GABA | SimgaAldrich | A2129 | Flexstation |
| Histamine | SimgaAldrich | H7125 | Flexstation |
| Glutamate | SimgaAldrich | 49621 | Flexstation |
| Epinephrine | SimgaAldrich | E4642 | Flexstation |
| Somatostatin | SimgaAldrich | S1763 | Flexstation |
| 5HT | SimgaAldrich | H9523 | Flexstation |
| VIP | Alpha Diagnostics Inc. | SP-69627 | Flexstation |
| Orexin A | Alpha Diagnostics Inc. | 12-p-01 | Flexstation |
| Substance P | SimgaAldrich | S6883 | Flexstation |
| Adenosine | SimgaAldrich | A4036 | Flexstation |
| Melatonin | SimgaAldrich | M5250C | Flexstation |
| Fluorescence Plate Reader & software | Molecular Devices | Flexstation 3 | Flexstation |
| DMEM (high glucose) with Glutamax | Life Technologies | 10569-010 | Tissue culture |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082-139 | Tissue culture |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Tissue culture |
| Puromycin | InvivoGen | ant-pr-1 | Tissue culture |
| Fibronectin | SimgaAldrich | F0895 | Tissue culture |
| CoolCell LX Alcohol-free controlled-rate cell freezing box | Bioexpress | D-3508) | Tissue culture |
| cyanoacrylate glue | Loctite | Loctite no. 495 | surgery and stereotaxic injection |
| plastic paraffin film | VWR | Parafilm® | surgery and stereotaxic injection |
| NANOINJECTOR | Drummond | 3-000-204 | surgery and stereotaxic injection |
| GLASS ELECTRODES | Drummond | 3-000-203G | surgery and stereotaxic injection |
| hand held drill | OSADA | Exl-M40 | surgery and stereotaxic injection |
| Burrs for drill | Fine Scientific | 19007-05; 19007-07) | surgery and stereotaxic injection |
| Sterilizing bath | FST | 18000-45, Hot Bead Sterilizer | surgery and stereotaxic injection |
| isoflurane chamber/mask | Highland Medical Equipment | 564-0427, HME 109 Table Top Anesthetic Machine with Isoflurane Vaporizer, O2 Flowmeter, Gang Valve; 564-0852, Induction Chamber 16X7X7.5cm | surgery and stereotaxic injection |
| 3D scope with arm | Zeiss | surgery and stereotaxic injection | |
| fiber optic light | surgery and stereotaxic injection | ||
| Betadine | surgery and stereotaxic injection | ||
| 70 % (v/v) isopropyl alcohol | surgery and stereotaxic injection | ||
| Povidone-Iodine Prep Pads | dynarex | 1108 | surgery and stereotaxic injection |
| NaCl 0.9% (INJECTION, USP, 918610) | surgery and stereotaxic injection | ||
| CYCLOSPORINE (INJECTION, USP) | surgery and stereotaxic injection | ||
| Buprenex (INJECTION) buprenorphine (0.03 μg per g rodent) | Sigma | surgery and stereotaxic injection | |
| Ophthalmic ointment | Akorn | NDC 17478-235-35 | surgery and stereotaxic injection |
| Surgifoam | Ethicon | surgery and stereotaxic injection | |
| Grip dental cement | Dentsply | #675571, 675572 | surgery and stereotaxic injection |
| Instant SuperGlue | NDindustries | surgery and stereotaxic injection | |
| LOCTITE 4041 | surgery and stereotaxic injection | ||
| METABOND | C&B | surgery and stereotaxic injection | |
| no. 0 cover glass | Fisher | surgery and stereotaxic injection | |
| stereotaxic frame | Kopf | surgery and stereotaxic injection | |
| Rectal probe and heating pad | FHC | 40-90-8D, DC Temperature Controller,40-90-2-06, 6.5X9.5cm Heating Pad40-90-5D-02, Rectal Thermistor Probe | surgery and stereotaxic injection |
| optical breadboard for imaging | Thorlabs | surgery and stereotaxic injection | |
| Mineral oil | Fisher | S55667 | surgery and stereotaxic injection |
| Kwik-Cast (Silicone elastomer) | World Precision Instruments | surgery and stereotaxic injection | |
| Suture | Ethicon | 18’’, 1667, 4-0 | surgery and stereotaxic injection |
| Scissors | Fine Scientific Tools | 91500-09, 15018-10 | surgery and stereotaxic injection |
| Forcepts | Fine Scientific Tools | 11252-30; #55, 11295-51; Grafe, 11050-10 | surgery and stereotaxic injection |
| Student Halsted-Mosquito Hemostats | Fine Scientific Tools | 91308-12 | surgery and stereotaxic injection |
| Small Vessel Cauterizer Kit | Fine Scientific Tools | 18000-00 | surgery and stereotaxic injection |
| Hot Bead Sterilizers | Fine Scientific Tools | 18000-45 | surgery and stereotaxic injection |
| Instrument Case with Silicone Mat | Fine Scientific Tools | 20311-21 | surgery and stereotaxic injection |
| Plastic Sterilization Containers with Silicone Mat | Fine Scientific Tools | 20810-01 | surgery and stereotaxic injection |
| 2P fixed-stage fluorescence scope for in vivo imaging | Olympus | FV1200 MPE | in vivo imaging |
| Multiphoton laser | SpectraPhysics | Mai Tai DeepSee | in vivo imaging |
| Green Laser | Olympus | 473 nm Laser | in vivo imaging |
| xy translation base | Scientifica | MMBP | in vivo imaging |
| FRET filter cube for YFP and CFP | Olympus | in vivo imaging | |
| 25-X water immersion objective | Olympus | in vivo imaging | |
| air table | Newport | in vivo imaging | |
| custom built light-tight cage | Thorlab | in vivo imaging |
Referências
- Day, J. C., Kornecook, T. J., Quirion, R. Application of in vivo. microdialysis to the study of cholinergic systems. Methods. 23, 21-39 (2001).
- Robinson, D. L., Venton, B. J., Heien, M. L., Wightman, R. M. Detecting subsecond dopamine release with fast-scan cyclic voltammetry in vivo. Clin Chem. 49, 1763-1773 (2003).
- Liang, R., Broussard, G. J., Tian, L. Imaging Chemical Neurotransmission with Genetically Encoded Fluorescent Sensors. ACS Chem Neurosci. , (2015).
- Okubo, Y., et al. Imaging extrasynaptic glutamate dynamics in the brain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 6526-6531 (2010).
- Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nat Methods. 10, 162-170 (2013).
- Nguyen, Q. T., et al. An in vivo biosensor for neurotransmitter release and in situ receptor activity. Nat Neurosci. 13, 127-132 (2010).
- Muller, A., Joseph, V., Slesinger, P. A., Kleinfeld, D. Cell-based reporters reveal in vivo dynamics of dopamine and norepinephrine release in murine cortex. Nat Methods. 11, 1245-1252 (2014).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. , e3998 (2012).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. , (2009).
- Conklin, B. R., Farfel, Z., Lustig, K. D., Julius, D., Bourne, H. R. Substitution of three amino acids switches receptor specificity of Gqα to that of Gjα. Nature. 363, 274-276 (1993).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat Protoc. 1, 3166-3173 (2006).
- Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J Vis Exp. , (2012).
- Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nat Methods. 7, 981-984 (2010).
- Shih, A. Y., et al. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. J Cereb Blood Flow Metab. 32, 1277-1309 (2012).
- Yamauchi, J. G., et al. Characterizing ligand-gated ion channel receptors with genetically encoded Ca2+ sensors. PLoS One. 6, e16519 (2011).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2, 932-940 (2005).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Cui, G., et al. Concurrent activation of striatal direct and indirect pathways during action initiation. Nature. 494, 238-242 (2013).
