For helt at forstå, hvordan neuroner kommunikere i hjernen, er det nødvendigt at have en metode til at måle frigivelsen af neurotransmittere in vivo. Der er flere veletablerede teknikker til måling neurotransmittere in vivo. En almindeligt anvendt teknik er mikrodialyse, i hvilken en kanyle er indsat ind i hjernen og et lille volumen af cerebrospinalvæske opsamles og analyseres under anvendelse af højtydende væskekromatografi og elektrokemisk detektion ^1. Mikrodialyse har en rumlig opløsning i størrelsesordenen nogle få diametre af proben, fx ~ 0,5 mm for en mikrosonde 200 um diameter. Den midlertidige opløsning af denne teknik er imidlertid langsom på grund af prøveudtagning intervaller, typisk varer ~ 5 min eller længere ^1. Desuden er analyser ikke foretages i realtid. En anden teknik er hurtig scanning cyklisk voltammetri (FSCV), som bruger en carbon-fiber probe, der indsættes i hjernen. FSCV har fremragende temporal opløsning (subsecond), høj følsomhed (nanomolær), og rumlig opløsning med sondens diameter på 5 til 30 um. Imidlertid er FSCV begrænset til sendere, der producerer en karakteristisk oxidation og reduktion Profilen med spænding på et carbonatom potentiometrisk føler ^2.

En tredje teknik til at måle neurotransmittere er direkte gennem genetisk kodet neurotransmitter (NT) biosensorer ^3. Med denne metode er et fusionsprotein skabt, der indeholder en ligand-bindende domæne til en sender koblet til en fluorescensresonansenergioverførsel (FRET) -baseret par fluoroforer ⁴ eller et permuteret GFP ^5. I modsætning til de to foregående metoder, er disse biosensorer genetisk kodet og udtrykt på overfladen af ​​en værtscelle, såsom en neuron, gennem produktion af transgene dyr eller akut med anvendelsen af ​​virale midler til at inficere celler. Til dato er genetisk kodet biosensorer kun blevet udviklet til detecting glutamat og GABA ^3-5. Begrænsninger med disse teknikker har været lav følsomhed, i nM-området, og den manglende evne til at udvide påvisningen af det store antal sendere, f.eks klassiske neurotransmittere, neuropeptider og neuromodulatorer, som signalerer gennem G-protein-koblede receptorer (GPCR'er). I virkeligheden er der næsten 800 GPCR'er i det humane genom.

For at løse disse mangler, har vi udviklet et innovativt redskab til optisk foranstaltning frigivelse af enhver neurotransmitter, der signalerer gennem en GPCR. CNiFERs (cellebaseret neurotransmitter fluorescerende manipuleret reportere) er klonale HEK293-celler manipuleret til at udtrykke et specifikt GPCR, at når stimuleres, udløser en stigning i intracellulær [Ca2 ^+], der detekteres af en genetisk kodet FRET-baserede Ca2 ⁺ sensor, TN-XXL. Således CNiFERs omdanne neurotransmitter receptorbinding til en ændring i fluorescens, der direkte og real-time optisk rEAD-out af lokale neurotransmitter aktivitet. Ved at udnytte den native receptor for en given neurotransmitter, CNiFERs bevarer kemisk specificitet, affinitet og tidsmæssige dynamik endogent udtrykte receptorer. Til dato har vi skabt tre typer CNiFERs, en for detektering acetylcholin ved anvendelse af M1-receptoren, en for påvisning dopamin ved hjælp af D2-receptoren, og en til detektering noradrenalin ved hjælp af a1a receptor ^6,7. Den CNiFER teknologien er let udvides og skalerbar, hvilket gør det muligt at foretage en hvilken som helst form for GPCR. I denne JOVE artikel beskriver vi og illustrere den metode til at designe, realisere og test in vivo CNiFERs for enhver ansøgning.