For å forstå hvordan nerveceller kommuniserer i hjernen, er det nødvendig å ha en metode for å måle frigivelsen av nevrotransmittere in vivo. Det er flere veletablerte teknikker for måling av nevrotransmittere in vivo. En vanlig brukt teknikk er mikrodialyse, hvor en kanyle er satt inn i hjernen og et lite volum av spinalvæske blir samlet opp og analysert ved hjelp av væskekromatografi og elektrokjemisk deteksjon ^en. Mikrodialyse har en romlig oppløsning i størrelsesorden noen få diametere på sonden, f.eks, ~ 0,5 mm for en 200 um diameter mikrosonde. Den tidsmessige oppløsning av denne teknikken, er imidlertid langsom på grunn av samplingsintervaller som vanligvis varer i ~ 5 min eller lengre ^en. Videre er analyser ikke gjøres i sanntid. En annen teknikk er rask scanning syklisk voltametri (FSCV), som bruker en karbon-fiber sonde som settes inn i hjernen. FSCV har utmerket temporal oppløsning (subsecond), høy følsomhet (nanomolar), og romlig oppløsning med sonde diameter på 5 til 30 mikrometer. Imidlertid er FSCV begrenset til sendere som frembringer en karakteristisk oksydasjon og reduksjon profil med spenning på et karbon potensiometrisk sonde ^2.

En tredje teknikk for å måle signalstoffer er direkte gjennom genetisk kodet nevrotransmitter (NT) biosensorer ^3. Med denne metoden blir et fusjonsprotein laget som inneholder en ligand-bindende domene til en transmitter koblet til en fluorescens-resonans energioverføring (FRET) -basert par av fluoroforer ⁴ eller en permutert GFP ^5. I motsetning til de to foregående fremgangsmåter, er disse biosensorer genetisk kodet og uttrykkes på overflaten av en vertscelle, slik som en nevron, gjennom produksjon av transgene dyr eller akutt med bruk av virale midler for å infisere celler. Hittil har genetisk kodet biosensorer er kun utviklet for detekteringg glutamat og GABA ^3-5. Begrensninger med disse teknikkene har vært den lave følsomhet, i nM område, og den manglende evne til å utvide deteksjons til det store antall sendere, f.eks klassiske nevrotransmittere, nevropeptider og neuromodulatorer, som signalerer via G protein-koblede reseptorer (GPCR). Faktisk er det nesten 800 GPCRs i det menneskelige genom.

For å møte disse manglene, har vi utviklet et innovativt verktøy til optisk måling utgivelsen av noen nevrotransmitter som signaliserer gjennom en GPCR. CNiFERs (cellebasert nevrotransmitter fluorescerende konstruert journalister) er klonale HEK293 celler konstruert for å uttrykke en bestemt GPCR at når stimulert, utløser en økning i intracellulært [Ca ^2+] som er oppdaget av en genetisk kodet FRET baserte Ca ²⁺ sensor, TN-XXL. Således CNiFERs omforme nevrotransmitter-reseptorbinding til en endring i fluorescens, noe som gir en direkte og real-time optisk rEAD-out av lokale neurotransmitter aktivitet. Ved å benytte den native reseptoren for en gitt nevrotransmitter, CNiFERs beholde den kjemiske spesifisitet, affinitet og tidsmessige dynamikken i endogent uttrykte reseptorer. Til dags dato, har vi laget tre typer CNiFERs, en for detektering av acetylkolin ved hjelp av M1-reseptoren, en for å detektere dopamin ved hjelp av D2-reseptoren, og en for å detektere noradrenalin ved hjelp av α1a reseptoren ^6,7. Den CNiFER teknologien er lett utvidbar og skalerbar, slik at det er mottakelig for alle typer GPCR. I denne Jove artikkelen beskriver vi og illustrere metodikken for å designe, realisere, og test in vivo CNiFERs for alle bruksområder.