بناء على أساس خلية العصبي نيون المهندسة مراسلون (CNiFERs) للكشف بصري من الناقلات العصبية<em> في فيفو</em
Summary
نقدم بروتوكول لإنشاء خلية القاعدة العصبي الفلورسنت للصحفيين المهندسة (CNiFERs) للكشف البصري الافراج عن العصبي الحجمي.
Abstract
خلية القاعدة العصبي الفلورسنت للصحفيين المهندسة (CNiFERs) توفير أداة جديدة لعلماء الأعصاب للكشف عن بصريا وإطلاق النواقل العصبية في الدماغ في الجسم الحي. يتم إنشاء CNiFER محددة من خلية الكلى الجنينية البشرية التي تعبر عن مستقر لG البروتين يقترن مستقبلات محددة، والتي الأزواج إلى G ف / 11 البروتينات G، والقائم على الحنق الكالسيوم 2+ -detector، TN-XXL. تفعيل مستقبلات يؤدي إلى زيادة في إشارة الحنق. CNiFERs ديك حساسية نانومتر وردا الزمنية ثانية لاستنساخ CNiFER تستخدم مستقبلات للمواطن وهو ناقل عصبي معين، على سبيل المثال، D2R للدوبامين. تزرع CNiFERs مباشرة في الدماغ، وتمكينهم من الشعور الافراج عن العصبي مع قرار المكاني لأقل من مائة ميكرون، مما يجعلها مثالية لقياس انتقال الصوت في الجسم الحي. ويمكن أيضا أن تستخدم CNiFERs لفحص أدوية أخرى لالمحتملين عبر التفاعل في السادسفو. قمنا بتوسيع مؤخرا عائلة CNiFERs لتشمل GPCRs أن الزوجين لG ط / س ع البروتينات. تتوفر للكشف عن أستيل كولين (ACH)، الدوبامين (DA) والنورادرينالين (NE) CNiFERs. وبالنظر إلى أن أي النوع من الاختزال يمكن استخدامها لخلق رواية CNiFER وأن هناك ما يقرب من 800 GPCRs في الجينوم البشري، ونحن هنا وصف الإجراء العام لتصميم وتحقيق، واختبار أي نوع من CNiFER.
Introduction
لنفهم تماما كيفية اتصال الخلايا العصبية في الدماغ، فمن الضروري أن يكون هناك طريقة لقياس إطلاق النواقل العصبية في الجسم الحي. هناك العديد من التقنيات الراسخة لقياس الموصلات العصبية في الجسم الحي. واحد التقنية المستخدمة شيوعا هو microdialysis، حيث يتم إدخال قنية في الدماغ وكمية صغيرة من السائل النخاعي التي يتم جمعها وتحليلها باستخدام عالية الأداء اللوني السائل وكشف الكهروكيميائية 1. Microdialysis لديها القرار المكانية بناء على أمر من عدد قليل من أقطار لجنة التحقيق، على سبيل المثال، ~ 0.5 ملم لمجهري 200 ميكرون قطر. القرار الزماني لهذه التقنية، ومع ذلك، هو بطيئا بسبب فترات أخذ العينات التي تستمر عادة ~ 5 دقائق أو أكثر 1. وعلاوة على ذلك، لا يتم إجراء التحليلات في الوقت الحقيقي. أسلوب آخر هو مسح سريع Voltammetry دوري (FSCV)، والذي يستخدم مسبار من ألياف الكربون التي يتم إدراجها في الدماغ. FSCV ديه درجة الحرارة ممتازةقرار شفوي (subsecond)، وحساسية عالية (nanomolar)، والقرار المكانية بأقطار التحقيق من 5-30 ميكرون. ومع ذلك، FSCV يقتصر على أجهزة الإرسال التي تنتج الأكسدة المميزة والشخصية تخفيض الجهد على الكربون الجهدية التحقيق 2.
وهناك تقنية أخرى لقياس الناقلات العصبية هي مباشرة من خلال الموصلات العصبية المشفرة وراثيا (NT) أجهزة الاستشعار 3. مع هذا الأسلوب، يتم إنشاء بروتين الانصهار التي تحتوي على نطاق ملزم يجند للمرسل بالإضافة إلى مضان بالرنين نقل الطاقة (الحنق) زوج المستندة من fluorophores 4 أو GFP permutated 5. وخلافا للأساليب السابقتين، هذه الحساسات يتم ترميز وراثيا وأعربت على سطح الخلية المضيفة، مثل الخلايا العصبية، من خلال إنتاج الحيوانات المعدلة وراثيا أو حاد مع استخدام العوامل الفيروسية لتصيب الخلايا. حتى الآن، وقد وضعت أجهزة الاستشعار المرمزة وراثيا فقط لdetectinز الغلوتامات وGABA 3-5. كانت قيود مع هذه التقنيات حساسية منخفضة، في نطاق نانومتر، وعدم القدرة على التوسع في الكشف عن وجود عدد كبير من أجهزة الإرسال، على سبيل المثال، العصبية الكلاسيكية، نيوروببتيد وneuromodulators، التي تشير من خلال مجموعة مستقبلات البروتين يقترن (GPCRs). في الواقع، هناك ما يقرب من 800 GPCRs في الجينوم البشري.
لمعالجة هذا النقص، قمنا بتطوير أداة مبتكرة لإطلاق قياس بصريا من أي الناقل العصبي الذي يشير من خلال هذه العملية من. CNiFERs (ناقل عصبي فلوري خلية القاعدة للصحفيين هندسيا) هي خلايا HEK293 نسيلي هندسيا للتعبير عن هذه العملية من معين، عندما حفزت، وموجبات زيادة في داخل الخلايا [كا 2+] التي يتم الكشف عنها من قبل كا 2+ استشعار القائم على الحنق المشفرة وراثيا، TN-XXL. وهكذا، CNiFERs تحويل مستقبلات الناقلات العصبيه ملزمة إلى تغيير في مضان، وتوفير الوقت الحقيقي المباشر وص البصريهيئة البيئة-من النشاط العصبي المحلي. من خلال الاستفادة من مستقبلات للمواطن وهو ناقل عصبي معين، CNiFERs الإبقاء على خصوصية الكيميائية، تقارب وديناميات الزمنية من المستقبلات التي أعرب عنها التطور الطبيعي. وحتى الآن، وقد انشأنا ثلاثة أنواع من CNiFERs، واحدة للكشف عن أستيل باستخدام مستقبلات M1، واحدة للكشف عن الدوبامين باستخدام مستقبلات D2، واحدة للكشف عن بافراز باستخدام 6،7 α1a مستقبل. التكنولوجيا CNiFER قابلة للتوسيع بسهولة وقابلة للتطوير، مما يجعلها قابلة للأي نوع من الاختزال. في هذه المقالة إن الرب، وصفنا وتوضيح المنهجية لتصميم، وتحقيق، واختبار في CNiFERs الجسم الحي لأي تطبيق.
Protocol
Representative Results
Discussion
إنشاء CNiFERs يوفر استراتيجية مبتكرة وفريدة من نوعها لقياس بصريا إطلاق النواقل العصبية في الدماغ في الجسم الحي. هي مناسبة بشكل مثالي لقياس CNiFERs الإفراج extrasynaptic، أي حجم التوصيل، لالناقلات العصبية. الأهم من ذلك، كل CNiFER تمتلك خصائص النوع من الاختزال الأصلي، وتوفي…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر ب كونكلين (جامعة كاليفورنيا، سان فرانسيسكو) لتوفير qi5 G و G qs5 cDNAs، A. شفايتزر للحصول على المساعدة مع الالكترونيات، N. تايلور للحصول على المساعدة مع فحص الحيوانات المستنسخة، إيان Glaaser وروبرت ريفكين للقراءة واقية واوليفييه Griesbeck لTN-XXL. وأيد هذا العمل من قبل المنح البحثية من خلال المعهد الأمريكي الوطني لتعاطي المخدرات (النداء) (DA029706، DA037170)، والمعهد الوطني للتصوير الطبية الحيوية والهندسة الحيوية (NIBIB) (EB003832)، هوفمان-لاروش (88610A) و "علم الأعصاب تتعلق بالمخدرات من منحة "التدريب إساءة من خلال النداء (DA007315).
Materials
| pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro | System Biosciences | CD510B-1 | Cloning: for generating lentivirus |
| 12×75 *BD Falcon High Clarity Polypropylene Round Bottom Test Tube | BD Biosciences | 352063 | FACS |
| BD 40 um Falcon cell strainers | BD Biosciences | 352340 | FACS |
| 0.05% Trypsin EDTA | Invitrogen | 25200056 | FACS |
| 96 Well Plate, flat bottom, clear | Corning | 3596 | FACS |
| 96 well cell culture plates | Corning | CLS3997 | Flexstation |
| Optilux black clear bottom | Corning | 3603 | Flexstation |
| Flexstation pipet tips | Molecular Devices | 9000-0911 | Flexstation |
| Acetylcholine Chloride | SimgaAldrich | A2661 | Flexstation |
| Norepinephrine | SimgaAldrich | A7256 | Flexstation |
| Dopamine Hydrochloride | SimgaAldrich | PHR1090 | Flexstation |
| GABA | SimgaAldrich | A2129 | Flexstation |
| Histamine | SimgaAldrich | H7125 | Flexstation |
| Glutamate | SimgaAldrich | 49621 | Flexstation |
| Epinephrine | SimgaAldrich | E4642 | Flexstation |
| Somatostatin | SimgaAldrich | S1763 | Flexstation |
| 5HT | SimgaAldrich | H9523 | Flexstation |
| VIP | Alpha Diagnostics Inc. | SP-69627 | Flexstation |
| Orexin A | Alpha Diagnostics Inc. | 12-p-01 | Flexstation |
| Substance P | SimgaAldrich | S6883 | Flexstation |
| Adenosine | SimgaAldrich | A4036 | Flexstation |
| Melatonin | SimgaAldrich | M5250C | Flexstation |
| Fluorescence Plate Reader & software | Molecular Devices | Flexstation 3 | Flexstation |
| DMEM (high glucose) with Glutamax | Life Technologies | 10569-010 | Tissue culture |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082-139 | Tissue culture |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Tissue culture |
| Puromycin | InvivoGen | ant-pr-1 | Tissue culture |
| Fibronectin | SimgaAldrich | F0895 | Tissue culture |
| CoolCell LX Alcohol-free controlled-rate cell freezing box | Bioexpress | D-3508) | Tissue culture |
| cyanoacrylate glue | Loctite | Loctite no. 495 | surgery and stereotaxic injection |
| plastic paraffin film | VWR | Parafilm® | surgery and stereotaxic injection |
| NANOINJECTOR | Drummond | 3-000-204 | surgery and stereotaxic injection |
| GLASS ELECTRODES | Drummond | 3-000-203G | surgery and stereotaxic injection |
| hand held drill | OSADA | Exl-M40 | surgery and stereotaxic injection |
| Burrs for drill | Fine Scientific | 19007-05; 19007-07) | surgery and stereotaxic injection |
| Sterilizing bath | FST | 18000-45, Hot Bead Sterilizer | surgery and stereotaxic injection |
| isoflurane chamber/mask | Highland Medical Equipment | 564-0427, HME 109 Table Top Anesthetic Machine with Isoflurane Vaporizer, O2 Flowmeter, Gang Valve; 564-0852, Induction Chamber 16X7X7.5cm | surgery and stereotaxic injection |
| 3D scope with arm | Zeiss | surgery and stereotaxic injection | |
| fiber optic light | surgery and stereotaxic injection | ||
| Betadine | surgery and stereotaxic injection | ||
| 70 % (v/v) isopropyl alcohol | surgery and stereotaxic injection | ||
| Povidone-Iodine Prep Pads | dynarex | 1108 | surgery and stereotaxic injection |
| NaCl 0.9% (INJECTION, USP, 918610) | surgery and stereotaxic injection | ||
| CYCLOSPORINE (INJECTION, USP) | surgery and stereotaxic injection | ||
| Buprenex (INJECTION) buprenorphine (0.03 μg per g rodent) | Sigma | surgery and stereotaxic injection | |
| Ophthalmic ointment | Akorn | NDC 17478-235-35 | surgery and stereotaxic injection |
| Surgifoam | Ethicon | surgery and stereotaxic injection | |
| Grip dental cement | Dentsply | #675571, 675572 | surgery and stereotaxic injection |
| Instant SuperGlue | NDindustries | surgery and stereotaxic injection | |
| LOCTITE 4041 | surgery and stereotaxic injection | ||
| METABOND | C&B | surgery and stereotaxic injection | |
| no. 0 cover glass | Fisher | surgery and stereotaxic injection | |
| stereotaxic frame | Kopf | surgery and stereotaxic injection | |
| Rectal probe and heating pad | FHC | 40-90-8D, DC Temperature Controller,40-90-2-06, 6.5X9.5cm Heating Pad40-90-5D-02, Rectal Thermistor Probe | surgery and stereotaxic injection |
| optical breadboard for imaging | Thorlabs | surgery and stereotaxic injection | |
| Mineral oil | Fisher | S55667 | surgery and stereotaxic injection |
| Kwik-Cast (Silicone elastomer) | World Precision Instruments | surgery and stereotaxic injection | |
| Suture | Ethicon | 18’’, 1667, 4-0 | surgery and stereotaxic injection |
| Scissors | Fine Scientific Tools | 91500-09, 15018-10 | surgery and stereotaxic injection |
| Forcepts | Fine Scientific Tools | 11252-30; #55, 11295-51; Grafe, 11050-10 | surgery and stereotaxic injection |
| Student Halsted-Mosquito Hemostats | Fine Scientific Tools | 91308-12 | surgery and stereotaxic injection |
| Small Vessel Cauterizer Kit | Fine Scientific Tools | 18000-00 | surgery and stereotaxic injection |
| Hot Bead Sterilizers | Fine Scientific Tools | 18000-45 | surgery and stereotaxic injection |
| Instrument Case with Silicone Mat | Fine Scientific Tools | 20311-21 | surgery and stereotaxic injection |
| Plastic Sterilization Containers with Silicone Mat | Fine Scientific Tools | 20810-01 | surgery and stereotaxic injection |
| 2P fixed-stage fluorescence scope for in vivo imaging | Olympus | FV1200 MPE | in vivo imaging |
| Multiphoton laser | SpectraPhysics | Mai Tai DeepSee | in vivo imaging |
| Green Laser | Olympus | 473 nm Laser | in vivo imaging |
| xy translation base | Scientifica | MMBP | in vivo imaging |
| FRET filter cube for YFP and CFP | Olympus | in vivo imaging | |
| 25-X water immersion objective | Olympus | in vivo imaging | |
| air table | Newport | in vivo imaging | |
| custom built light-tight cage | Thorlab | in vivo imaging |
Referências
- Day, J. C., Kornecook, T. J., Quirion, R. Application of in vivo. microdialysis to the study of cholinergic systems. Methods. 23, 21-39 (2001).
- Robinson, D. L., Venton, B. J., Heien, M. L., Wightman, R. M. Detecting subsecond dopamine release with fast-scan cyclic voltammetry in vivo. Clin Chem. 49, 1763-1773 (2003).
- Liang, R., Broussard, G. J., Tian, L. Imaging Chemical Neurotransmission with Genetically Encoded Fluorescent Sensors. ACS Chem Neurosci. , (2015).
- Okubo, Y., et al. Imaging extrasynaptic glutamate dynamics in the brain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 6526-6531 (2010).
- Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nat Methods. 10, 162-170 (2013).
- Nguyen, Q. T., et al. An in vivo biosensor for neurotransmitter release and in situ receptor activity. Nat Neurosci. 13, 127-132 (2010).
- Muller, A., Joseph, V., Slesinger, P. A., Kleinfeld, D. Cell-based reporters reveal in vivo dynamics of dopamine and norepinephrine release in murine cortex. Nat Methods. 11, 1245-1252 (2014).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. , e3998 (2012).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. , (2009).
- Conklin, B. R., Farfel, Z., Lustig, K. D., Julius, D., Bourne, H. R. Substitution of three amino acids switches receptor specificity of Gqα to that of Gjα. Nature. 363, 274-276 (1993).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat Protoc. 1, 3166-3173 (2006).
- Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J Vis Exp. , (2012).
- Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nat Methods. 7, 981-984 (2010).
- Shih, A. Y., et al. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. J Cereb Blood Flow Metab. 32, 1277-1309 (2012).
- Yamauchi, J. G., et al. Characterizing ligand-gated ion channel receptors with genetically encoded Ca2+ sensors. PLoS One. 6, e16519 (2011).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2, 932-940 (2005).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Cui, G., et al. Concurrent activation of striatal direct and indirect pathways during action initiation. Nature. 494, 238-242 (2013).
