Все процедуры будут одобрены Комитетом по LSUHSC институциональной уходу и использованию животных в общем и были проведены в соответствии с НИЗ "Принципы лабораторной ухода за животными." 1. грызунов Акклиматизация и пищевой Ограничение Использование взрослых крыс линии Вистар, которые 3 месяца в начале эксперимента. House крыс по отдельности в клетках, оборудованных блоком ламинарного потока и воздушного фильтра в температурно и контролируемой влажностью, AAALAC аккредитованного ухода за животными на обращенной 12-часовой цикле свет / темнота (свет от в 0600 ч). Обеспечить воду и стандартный корм для грызунов свободно, пока вес тела не примерно 380 – 400 г. Впоследствии, пищевой ограничить крыс и поддерживать на 85 до 90% своих свободных вскармливания массы тела в течение эксперимента сессий для облегчения приобретения и обслуживания ответ на метамфетамин. Ручка грызунов в клетку номер ежедневно с момента прибытия в течение экспериментальногосессий в целях регистрации веса тела и регулировать распределение пищи ежедневно. После того, как целевые веса достигается, подготовиться к хирургическим имплантировать каждый крысу с хроническим пребывающего яремной катетер и внутричерепных стимулирующих электродов. 2. Катетеризация яремной вены Катетер Подготовка Подготовьте 13-см длины силиконовой трубки с внутренним диаметром 0,012 х 0,025 ", создать силиконовой мяч 4 см от одного конца трубки с помощью дополнительных трубок силиконовой и электрокоагуляции, и дайте высохнуть на воздухе. Падение другой конец трубки в лимонен растворителя на основе полученной из цитрусовых в течение нескольких минут и позволит расширить. Подключите трубку к расширенной нержавеющей стали направляющей канюли согнуты под прямым углом. Якорь изогнутую основу из нержавеющей стали направляющей канюли к 1 "квадрат биосовместимого сетки с использованием зубной акриловой цемент. Промойте катетер внутри и снаружи с этанолом и дистиллированной водоснар. Вдохнуть воздух через трубку, чтобы устранить оставшиеся капли жидкости. Дайте высохнуть O / N. Стерильная техника Выполните все операции в специальном животных хирургического набора, используя асептические хирургические методы. Стерилизовать инструменты и имплантаты, используя автоклав и подготовить стерильный область путем размещения водонепроницаемая бумага на столе или покрытые стерильной полотенце (ов). Носите стерильные перчатки и держать все инструменты, имплантаты и хирургическое марлю на стерильной зоне во время процедуры. Протрите каждый инструмент с тампоном алкоголя, а затем 20 сек в шаровой стерилизатора между процедурами, когда несколько операций выполняются. Анестезия Предварительной обработки крыс с атропином (сульфат) (0,04 мг / кг, кв), а затем пентобарбиталом (20 – 50 мг / кг, внутрибрюшинно) для достижения анестезии. Вводите животных стерильной пенициллин G прокаин (75000 приостановления единиц, IM) и болеутоляющее средство (Carprofen, 5 – 10 мг / кг, подкожно или кетoprofen, 2 – 5 мг / кг, подкожно) непосредственно перед операцией, чтобы уменьшить послеоперационные инфекции и боль, соответственно. Проверьте адекватной анестезии, обеспечивая умеренное ног щепотку животному, и, если не происходит никакого ответа, а затем приступить. Применение глаз смазку обоих глаз. Подготовка Хирургическая сайта Бритье 2 х 2 см спинной пятно на спине крысы просто позади линии, соединяющей лопатки. Брить 1 х 1 см вентральной патч в области шеи справа между челюстной кости и позвоночника. Протрите бритой области с колодки алкоголя с последующим бетадином решения. Поместите крысу на стерильную полотенце и дайте высохнуть Бетадин, прежде чем продолжить. Катетер Имплантация Надрезать параллельно линии, соединяющей лопатки в межлопаточную область на задней использованием 10-лезвие ножа. Используйте кровоостанавливающего, чтобы отделить кожу от основной соединительной ткани, чтобы создать самолет длясетка катетера базу. Промывать область с стерильного физиологического раствора и покрывают стерильной марлей до поворота крысу на спину. Сделайте надрез по диагонали между правой челюстью и грудины с использованием 10-лезвие ножа. Использование кровоостанавливающего, чтобы отделить кожу от основной соединительной ткани, чтобы найти в яремную вену. Примечание: яремной вены появляется белый / серебро и блестящими и больше у самцов крыс, чем у самок. Поместите шпатель под вену, связать 4-0 шелковой нити мягко вокруг верхней части (проксимального) из открытой вены и нажмите вену обратно в шею. Отделите соединительные ткани, чтобы создать поверхностную карман под нижнебоковой кожи шеи, но над мышцей. Нажмите стерилизованного троакар из шеи разрез на межлопаточную разрез через тоннель обратно за руку и вверх. Запустите катетер со спины к шее, вставив жесткой направляющей проволоки до через троакар с конца шеи и в дистальных катетера. Потянитенаправлять провод обратно до шеи разрез и прилагаемой дистального катетера будет следовать. Изолировать правильный яремную вену над шпателем, потянув вверх на ранее размещенных проксимального шва. Используйте мяч ножницами сделать небольшой надрез на частичную верхней стороне вены. Вставьте изогнутый пинцет в вену разрез, чтобы открыть его. Ведение щипцы раздельно, но в месте, пройти катетера между щипцы советы и в вену около 2 – 3 см, где это кончится вне правого предсердия. Закрепите катетер, связывая 4-0 шелковой нити вокруг дистальной вены. Свяжите проксимальный и дистальный швов вместе в "ящик" узел, чтобы добавить дополнительную стабильность. Флеш катетер с гепарином стерильного физиологического раствора и отступать в крови, чтобы подтвердить успешную имплантацию. Обрезать швов 1 – 2 мм выше узлов и уложить оставшуюся проксимального катетера под кожей шеи. закрыть с соответствующим швов / метод по вашему выбору. Если не-absorbable швы или скобы используются, они должны быть удалены в 10-14 дней под общим наркозом. Обложка разрез с мазь с антибиотиком, используя стерильный аппликатор хлопка наконечник. Закрепите сборку дистального катетера / руководство канюли / сетки на подкожную ткань, используя заднюю рассасывающиеся швы на двух противоположных углах основания сетки. Закройте заднюю разрез вокруг направляющей канюли с использованием прерывается, неинвертированный рассасывающиеся швы. Обложка разрез с мазь с антибиотиком, используя стерильный аппликатор хлопка наконечник. Ведение послеоперационного периода Флеш катетер с гепаринизированной 0,9% стерильным физиологическим раствором, используя 3 мл шприц и поместите обтуратор в направляющий катетер, чтобы предотвратить засорение. Промойте катетер каждой крысы на ежедневной основе, чтобы сохранить проходимость. Сразу же после процедуры, поместите его в крысу клетку над грелку в хирургическом люкс и не заметить, пока сознание и стихийного возвращения движения. Вернуться восстановленный крысу в колонии комнату и позволяют пяти до семи дней, чтобы пройти, прежде чем внутричерепного хирургии. Взвесьте, обрабатывать и оценивать их общее состояние в день, в том числе проверка на инфекции и оценки поведения животных, появление и уровни активности. Проконсультируйтесь с ветеринаром животных ресурсов, если возникнут какие-либо проблемы, и следить за рекомендованные схемы лечения. Вводите животных с анальгетика (Carprofen, 5 – 10 мг / кг, подкожно или кетопрофен, 2 – 5 мг / кг, подкожно) для лечения периоперационной боли по мере необходимости. 3. Внутричерепное Электрод Размещение Хирургическая подготовка Выполните все операции в стерильных условиях, как описано в разделе 2.2. Анестезия Поместите животное в индукционной камере анестезии и обеспечивают isoflurance газовый поток в камере при 1000 – 2000 мл / мин с испарителем установлена на уровне 5%. После того, как животное в лежачем положении, снимите с камеры ае место в носовой конус на мягкой стереотаксической операционной платформы. Переключение потока газа из камеры для носового конуса и запустить газ с испарителем установлен на 2 – 3%. Отрегулируйте испаритель, сколько необходимо для поддержания стабильных Дыхание и нет ответа на стимуляцию во время операции. Вводите крысу стерильной пенициллин G прокаин (75000 приостановления единиц, IM) и болеутоляющее средство бупренорфин (от 0,05 до 0,5 мг / кг подкожно) непосредственно перед операцией, чтобы уменьшить послеоперационные инфекции и боль, соответственно. Проверьте адекватной анестезии, обеспечивая умеренное ног щепотку животному, и, если не происходит никакого ответа, а затем приступить. Применение глаз смазку обоих глаз. Подготовка Хирургическая сайта Бритье верхней части головы крысы и поместить крысу в ухо баров, чтобы держать голову неподвижно его во время процедуры. Протрите бритой области с колодки алкоголя с последующим бетадином решения. Дайте высохнуть Бетадин, прежде чем продолжить. Электрод Имплантация Возьмитесь за головы между и немного впереди ушей с пинцетом и использовать ножницы, чтобы вырезать по базе. Это manuveur снимет 1,5 х 1 см участок кожи над середине черепа. Используйте 10-лезвие, чтобы сделать круговую разрез через перикраний до черепа и изогнутым пинцетом, чтобы соскоблить и удалить перикраний. Промывать область с стерильного физиологического раствора, промокните излишки крови и физиологический раствор марлей, и дайте высохнуть черепа полностью, так костные ориентиры, в том числе брегмы, может быть хорошо видно. Для двустороннего хирургии, монтаж двух биполярных платиновых электродов, иридий один в каждой держателя электрода по обе стороны от стереотаксической операционной платформы. Перемещение первый электрод в положение ~ 1 мм над брегмы и запишите стереотаксические координаты для передне-задней (AP) и медиальной-боковой (ML) позиции, которые будут показываться на цифровом дисплее. На самом деле не прикасайтесь кончик электрода к скУлла, потому что электрод больше не будет функционировать. Повторите эту процедуру для другого электрода. Расчета конечного AP и ML координат на основе целевой интересующей структуры. Перемещение электрода на эту должность с наконечником только выше черепа, чтобы получить начальную дорзовентральной (DV) координат на цифровом дисплее. Рассчитать конечной глубине DV на основе целевой структуры интереса. Примечание: прилежащем ядре оболочки была направлена в этом примере, учитывая его участие в известных наркотиков consummatory поведения 8, используя следующую стереотаксической координаты относительно брегмы: AP запись координат = [цифровом виде координат в темя] + 1,6 ML запись координат = [цифровом виде координат в темя] ± 2,4 для вправо / влево Глубина DV = [цифровом виде координат в череп поверхности в AP / ML вступления] – 8,5 Отметить положение проецируемого входа каждого электрода на поверхности черепа с постоянным маrker. Не врезаться и не прикасайтесь кончиком электрода во время этого маневра. Используйте круглый заусенцев покрытием мяч с бриллиантами, чтобы развернуть 1.4 мм отверстие в каждой марки. Будьте осторожны, чтобы не погрузиться в черепе в внутричерепного свода с высокоскоростной дрелью. Используйте пинцет, чтобы изогнутые прокол твердой мозговой оболочки, как только череп была пробурена прочь. Используйте круглый шар с алмазным покрытием заусенцев пробурить 0,7 мм отверстия в дополнительных четырех местах позади электродных записей для размещения черепа винтов. Использование ручной отвертки разместить четыре 0,8 (диаметр) х 3,2 (длина) мм винты из нержавеющей стали в череп, по два с каждой стороны средней линии. Плотно закрыть эти винты до примерно половины их длины в череп, потому что они являются основным инфраструктура, которая будет держать черепной крышки на месте в течение ближайших недель и месяцев. Осторожно вставьте первый электрод через burrhole в мозг к расчетной глубины DV вручную поворотом ручки, которая управляет Z-координатадержатель электрода. Включите ручку со скоростью примерно равной 1/2 оборота в секунду, чтобы предотвратить чрезмерное повреждение кончика электрода. Убедитесь, что кончик электрода не прикасайтесь к костлявой краю burrhole при входе в мозг. Безопасный первый электрод, используя клей высшего наложить на burrhole и задних винтов, а затем зубным цементом. После того, как эта конструкция полностью высохнет, снимите электрод из держателя. Повторите процесс вставки и цементирования для второго электрода. Применить стоматологического цемента вплоть до края кожи, но не перекрываются с кожей, потому что это ослабляет черепной крышки цемента в долгосрочной перспективе. Ведение послеоперационного периода Поместите два защитные колпачки поверх электродных пьедесталах, чтобы предотвратить засорение. Сразу же после процедуры, поместите его в крысу клетку над грелку в хирургическом люкс и не заметить, пока сознание и стихийного возвращения движения. Вернуться восстановленный крысу йе колония зал и позволяют пять дней, чтобы пройти перед началом эксперимента. Взвесьте, обрабатывать и оценивать общее состояние крыс ежедневно, в том числе проверка на инфекции и оценки поведения животных, появление и уровни активности. Проконсультируйтесь с ветеринаром животных ресурсов, если возникнут какие-либо проблемы, и следить за рекомендованные схемы лечения. Вводят животным с анальгетика (бупренорфин 0,05 до 1 мг / кг подкожно) для лечения боли периоперационный по мере необходимости. Внутричерепное кровотечение может быть более распространенным с использованием нестероидных обезболивающих (Carprofen, 5 – 10 мг / кг, подкожно или кетопрофен, 2 – 5 мг / кг, подкожно), так что используйте бупренорфин периоперационно для внутричерепного хирургии. 4. Аппарат Оперантное Используйте пластика и нержавеющей стали оперантного кондиционирования камерах, содержащейся в шкафах звуковых-ослабления запустить поведенческие эксперименты. Экипировка каждый корпус с вытяжным вентилятором для подачи вентиляции и белый NOISE, чтобы замаскировать посторонние звуки. Используйте персональный компьютер и поведенческие системы программный интерфейс для программирования процедуры и собрать экспериментальные данные. Генеральный Настройка Оснащение каждого экспериментальной камере с двух рычагов, установленных на ответных одной стенке камеры с стимула света, расположенного над каждой рычага. Назначить один из рычагов «активный» рычаг так, что это приводит в запрограммированной следствие при нажатии. Запрограммируйте стимул свет, расположенный непосредственно над активным рычагом ответ, чтобы осветить во время каждого оперантного сессии, с указанием наличия препарата. Есть ответ на активном результате рычага в поставке инфузии метамфетамина (0,05 мг / кг / в инфузии в 100 мкл 0,9% NaCl) в течение 2,8 сек в сопровождении дома света на противоположной стене происходит в течение 5 сек, а стимулом свет, идущий ВЫКЛ для тайм-аута 30-сек. Граф ответов на активном рычаг, но они не должны иметь никаких запланированных conseпоследствиями в период тайм-аута 30-сек. Для завершения записи ответов на неактивный рычаг, но они не должны иметь никаких последствий запланированных. 5. Внутривенное (IV), метамфетамин самоуправление Порядок Общая подготовка Загрузка крыс в оперантного камер, как быстро и спокойно, как можно свести к минимуму поведенческие артефакты. Приложите пружина из нержавеющей стали поводок направляющей канюли на спине грызуна и в герметичной поворотной жидкости, подвешенную над оперантного камеры. Обеспечение целостности трубопровода соединений с поворотной к наркотиков шприц 20 мл в мотопомпы, расположенной за пределами звука, ослабление корпуса. Чтобы сделать это, нажмите пластмассовую трубку соединения, по меньшей мере ¼ дюйма на кончике металл поворотной и иглы шприца наконечником препарат до тех пор, пока не будет соскальзывать с умеренной тянуть. Встречное сбалансировать поворотный узел и поводок, чтобы разрешить относительно безудержный мovement животного. Провести оперантного сессии примерно в то же время каждый день с понедельника по пятницу. Получение Для того, чтобы облегчить быстрый приобретение IV метамфетамина самоуправления, работающие крыс на ежедневных сеансов 6-час в течение четырех-пяти дней подряд. Провести эти занятия по фиксированной соотношении график FR-1 до + 30 сек reinforcementduring котором крысы получают один настой IV метамфетамина при каждом нажатии на активный рычаг с последующим 30 сек тайм-аут (например, не наградить нет кий или последствия возникают с нажатием либо рычага). Примечание: Эта начальная длительная и "просто" доступ приведет в большинстве грызунов, приобретающих значительное наркотиков, принимая поведение в менее или равным одной недели (рисунок 3). Обслуживание В течение второй недели обучения, работают крыс на ежедневных сеансов 2-ч с понедельника по пятницу, чтобы сохранить результаты IV methamphetamine самоуправления. Проведение заседания по фиксированной отношение FR-1 до + 30 сек график тайм-аута арматуры. Документ стабильной, интенсивно реагирует, когда общее количество метамфетамина презентаций по каждой сессии колеблется меньше, чем 10% в течение трех сессий подряд (рисунок 4) и общим числом инфузий через первый 30-мин больше, чем совокупное число настоев во время второй 30-мин (рисунок 5). Примечание: Этот критерий гарантирует, что крысы разработать лекарственное средство загрузки шаблона в начале сессии, который указывает привыкание поведение 19, а не просто повседневного использования. После сеанса В конце каждой сессии, отсоедините поводок от задней грызуна. Промойте катетер с 0,1 мл 0,9% раствора, содержащего 800 солевой МЕ стрептокиназы, чтобы предотвратить образование тромбов. Вставьте затвор в каждом направляющей канюли, чтобы предотвратить засорение перед возвращением гАТС в домашних клетках. Тест проходимости катетеров сразу после окончания каждой экспериментальной сессии по средам в течение всего хода эксперимента. Подготовьте 3 куб.см шприц с иглой 22 G, содержащий Гепаринизированные бактериостатическое солевой раствор, чтобы проверить катетера. Прикрепите один конец 4 6 дюймов длинной части пластиковой трубки и иглы, а другой конец к металлической должность катетер-канюли на спине животного. Настаивать 0,1 до 0,2 мл физиологического раствора, чтобы обеспечить четкое поток, а затем сделать поршень шприца назад. Если катетер патент, он должен как флеш легко и отступать кровь, которая будет видна в трубке. Выпуск поршень и влить еще 0,2 мл для промывки всю кровь обратно через катетер. Если кровь не может быть отозвано, а затем удалить 3 куб.см шприц и трубку от металлического должности. Подготовьте 1 куб.см шприц с иглой 22 G, содержащий Methohexital натрий, быстро действующийанестетик, к дальнейшему тест проходимости катетера. Прикрепите один конец 4 6 дюймов длинной части пластиковой трубки и иглы, а другой конец к металлической должность катетер-канюли на спине животного. Настаивать 1,5 мг и быстро удалить 1 куб.см шприц и трубку от металлического сообщению на спине животного. Подключите 3 куб.см шприц с гепарином физиологического раствора бактериостатическим и настоять 0,1 – 0,2 мл. Если животное теряет мышечный тонус в пределах 3 сек, затем катетер патент и функциональный. См Дополнительного Файл "Распространенные ошибки" для раздела ловушек, которые адресует неблагоприятных реакций на метамфетамин, неспособность приобрести метамфетамина самоуправления и экстракции крысы сложности. 6. Стимулирование Аппарат мозга Используйте 10 до 12 плексигласа коробки (12 х 18 х 18 в) (ШхВхГ), чтобы запустить эксперименты DBS. Обложка каждую коробку снаружи с жесткой непрозрачнойдокумент, который охватывает спину и бока ящика, чтобы предотвратить крыс от просмотра или взаимодействующих друг с другом. Оставьте на лицевой панели непокрытой поэтому эксперт может просмотреть животных во время сессий стимуляции. Обложка вершины коробки с полупроницаемой панели, что предотвращает крыс от побега, позволяя воздушного потока. Используйте эту панель, чтобы поддержать коммутаторы, расположенные над каждой коробке, чтобы облегчить электрическое соединение между головкой грызунов и системы стимулирования. Используйте систему стимуляции, которая может обеспечить постоянный ток в несколько одновременных животных для экспериментов DBS. Используйте систему, состоящую из программируемый интерфейс Digital Signal Processor / связи пользователя, стимулятор, стимулятор аккумулятор, сплиттер канал окно, и сопровождающее программное обеспечение (См материалы лист). Используйте заказной длины кабелей для подключения портов канала стимулятор для превосходной электронной пьедестале каждого commutatили. Примечание: необходимой длины будет зависеть от индивидуального лаборатории. Эти кабели находятся за пределами области животных и не должны быть покрыты пружиной из нержавеющей стали. Подключите нижнюю электронный пьедестал коммутатора для имплантированного электрода пьедестала на головкой грызуна с использованием 16-кабелей, покрытые пружиной из нержавеющей стали. Убедитесь, что кабели достаточно длинными, чтобы позволить свободное движение к каждому части шкафа без существенных напряженности на головкой. Примечание: Кабель, который заканчивается примерно, где глава крысы будет, когда, стоя на всех четырех ногах, как правило, достаточно. Стимуляция мозга Программирование Использовать персональный компьютер и программное обеспечение для программирования для программирования параметров стимуляции (например, формы волны, частоты, длительности импульса, задержка между стимулом, амплитуда тока) и собрать экспериментальные данные. Использование визуального языка программирования, указать, какие функции каждое устройство будет выполнить, чтобы отвечать экспериментовпсихические конечные и какие данные будут храниться и / или планируемых для просмотра в режиме реального времени. Команды, которые управляют этим конкретного проекта демонстрируются на рисунке 1. Укажите нужную частоту, длительность импульса, и амплитуды в визуальном панели управления (рисунок 2) до начала эксперимента. Типичные параметры для высокочастотной стимуляции у крыс аналогичны тем, которые используются в клинической человека глубокой стимуляции мозга: частота 130 до 180 Гц, длительность импульса от 60 до 90 мс, а амплитуда тока 100 мкА до 250 4,8-10. Примечание: более низкий ток используется в грызунов из-за его уменьшенного размера по сравнению с приматов. 7. Глубокая стимуляция мозга Порядок Чтобы загрузить крыс в ящики, прикрепить пружина из нержавеющей стали кабель от коммутатора к каждому электрода пьедестала на головкой. Проверьте сопротивление каждого электрода, запустив 5 мкА тока при частоте1,000 Гц в течение 2 сек. Если сопротивление равно или меньше, чем 125 кОм, а затем продолжать эксперимент, поскольку электрод способен доставить терапевтическую стимуляцию. Если сопротивление больше, чем 125 кОм, рекомендуется удалить животное из эксперимента, потому что высокая устойчивость электрода может обрезать ток потенциально суб-терапевтических уровнях. Запуск крыс через один или два ложных сессий для привыкания, в течение которого они будут прикреплены к электродной кабеля (ы), но не получая никакой активной терапии. Якобы тестирование устранить любые неспецифические поведенческие эффекты. Сразу же после каждого сеанса макет, транспортировки крыс на оперантного коробки для ежедневного сеанса 2-ч IV метамфетамина самоуправления. Уравновесить крыс на две группы, для активного стимуляции и обман стимуляции когорте так, что базовый прием лекарств существенно не отличается между группами. Выполните ежедневное сессии DBSс на когорты грызунов в течение 5 дней, в течение которых они получают либо активное электрическую стимуляцию мозга или нет стимуляции в течение 3 часов в зависимости от их назначения группы. Сразу же после каждого сеанса DBS, транспортных крыс оперантного коробки для ежедневного сеанса 2-ч IV метамфетамина самоуправления. Заметим, животных осторожно в течение по меньшей мере, на части каждой сессии DBS, чтобы убедиться, стимуляция не вызывает четкие изменения в поведении животных. Если какие-либо ненормальное поведение происходят во время / после стимуляции, заботиться, чтобы документировать эти замечания. Примечание: авторы не заметили значительные изменения поведенческих или изменения в потреблении продуктов питания / воды во время эксперимента, описанного в этой статье. Измените продолжительность лечения DBS, электрических параметров, а время между сессии DBS и оперантного сессии по мере необходимости в зависимости от гипотезы.