再加上高灵敏度指纹碳水化合物自动分析模块化高通量筛选胞外多糖平台

1.自动筛选注意：所有液体处理步骤与机器人液体处理系统完成的。机器人工作台的组合物示于图2中 ，所有的消耗品被存储在存储传送带，除非另外提及。对于所有的自动筛选步骤a机器人操纵器（RM）移动消耗品，（深孔板（DWP）;微滴定板（MTP）;聚合酶链反应板（PCR板）等）的转盘位置之间（CP ）和工作台位置（WTP）。所有吸移管的步骤与一个96通道移液器臂进行的，如果它被另外提及除外。所有步骤被编程，并在96-孔格式自动地执行。 菌株培养（任务1在图1） 注：处理推定的车生产菌株的接种和无菌条件（层流）下的培养板的密封。自动化快速筛选每秒可以处理运行四个96孔板。几个属不同菌株已经测试6。 手动从96孔甘油板96针复制器接种预培养（1毫升EPS-媒体在DWP）。覆盖透气密封膜的板，以避免蒸发和以允许通气。孵育在30℃下48小时以1,000rpm上的MTP-摇床。 用50微升12通道多吸量管和相同的条件预培养下孵育转印10微升预培养接种主培养物（在一个DWP 990微升EPS-介质）。以记录所有不生长的菌株。 机器人工作台和存储旋转木马的制备提供在材料和设备列出在存储转盘正确位置所有消耗品。在DWP的每孔加入双蒸水990微升（DDH 2 O）为1：100稀释液次Ë葡萄糖测定法（转盘位置4-1到4-4）。 安排250毫升槽装有150毫DDH 2 O的在工作台位置（WTP）11。 沉积的250ml槽含有50ml葡萄糖测定试剂混合（4毫升500毫摩尔磷酸钾（pH 5.7），将1.5ml的50mM 2.2 azinobis-（3ethylbenzthiazoline）-6-磺酸，加入2ml 100单位葡萄糖氧化酶， 10微升1000ü辣根过氧化物酶，并且位置WTP 1-242.49毫升的DDH 2 O）。 将两个空的虚拟F-底部台胞证在位置WTP 3-1和3-2。 取下透气密封膜，分配主文化的转盘位置（CP）1-1到1-4，并开始自动机器人程序。 凝胶过滤板的平衡注意：在本筛选中使用的凝胶过滤板可重复使用。对于这一点，在20℃洗涤和离心分离3次，每次用150微升的DDH 2 O为在2000 xg离心2分钟。此后，储存在4°下用75微升20％的乙醇中并用一个硅帽垫覆盖。 移动用5mM乙酸铵缓冲液（pH 5.6），以在WTP 3-3 250mL的槽（CP 5-7）。 传送从传送带凝胶过滤板（CP 1-6，1-7，2-6和2-7）的支付意愿4-1至4-4。 用吸200微升的提示，分装到了平衡所有凝胶过滤板的中心醋酸铵缓冲液150微升。 传送凝胶过滤板进入离心机（2000 xg离心2分钟，在20℃）。 转移板回到工作台，重复步骤1.3.3，1.3.4和1.3.3。不重复离心步骤，以避免凝胶过滤板的脱水。存储平衡凝胶过滤板传送带内回来。 通过离心细胞去除（任务1在图1） 注意：为了确保所述筛选方法中的一个低的背景，分析无细胞只含EPS上清和培养后通过离心除去细胞。 从传送带（1-1〜1-4）进入离心机传送主培养DWP（4300 xg离心30分钟，在20℃）。 通过RM准备工作台加工为主的文化。 注意：对于步骤1.4.2至1.4.3.5系统总是处理两个平行板，然后重复连下两盘的所有步骤。 对于过滤前的降雨从CP 6-1和6-2移动MTP到WTP 4-1和5-1。从CP 7-1和7-2移动pH指示剂台胞证到WTP 4-2和5-2。 从CP 2-1和2-2与集电板一起传送滤板到WTP 4-3和5-3。从离心机搬迁的主要文化DWP 1-1和1-2到4-4的WTP和5-4。 准备分析模块。 注：请从尖端存储（位置2-1〜2-4）200微升提示。为了降低消耗品，使用相同的尖部 – 组为第1步.4.3.1。 转移180微升主培养上清液到过滤板上。从主培养物上清液吸出150微升并分配50微升到MTP沉淀过滤之前和100微升至pH指示剂板上。 注：pH的确定是不必要的;然而，加入各孔12.5毫升甲基红指示剂（50毫克在50ml乙醇中）与一个多步骤移液器之后它表示高酸生产菌株。这个信息可以是，以避免进一步的栽培， 例如 ，用于具有较高的缓冲液浓度的第二筛选生长抑制（在低pH值）是有用的。此外，低pH值还可能诱发车生产，以保护免受酸性环境的小区。 重复步骤1.4.3.1对于第二主培养板。选用一个新鲜尖集。 移动过滤板的离心机，并从工作表中删除所有其他板块回自己的家的位置在carous埃尔。 重复这些步骤1.4.2.1到1.4.3.3对于第三和第四主培养板。 做笔记的发酵液，其中展示的主要培养板离心后沉降下降，当他们被转移回转盘（粘度控制）的。 96孔过滤完整细胞去除（任务2 图1） 注意：为了确保从粘性发酵肉汤的过滤步骤包括在筛选细胞去除。 离心过滤板在3000 XG 10分钟，在20°C，并把他们带回自己的转盘位置。 制备凝胶过滤板。 移动从转盘到离心机和自旋的平衡凝胶过滤板在1000 xg离心2分钟，在20℃。 从离心机传送凝胶过滤板，以WTP 4-1〜44。 移动清新凝胶- 过滤收集板从CP（3-1〜3-4），以WTP（5-1到5-4）。 转移平衡凝胶过滤板（WTP 4-1〜4-4），以新鲜集电板（5-1至5-4）。 清理除位置5-1和5-2工作台移动位置5-1到4-1的位置。 通过RM准备工作台处理滤液。 注意：对于步骤1.5.3至1.6.3.5系统处理两个平行板和重复连下两盘的所有步骤。 移动从传送带（4-6和4-7）50微升提示，WTP 3-3和3-4。 转自CP 3-1 3-2过滤板到工作台（4-4和5-4）。 重新定位DWP（1：100稀释），用于从CP 4-1,4-2检测的葡萄糖消耗至WTP 4-2和5-1。 将第二降水MTP从CP 8-1和8-2过滤后的污水处理厂4-3和5-3。 从集电板提起过滤板S（WTP 4-4和5-4），并将其移动到WTP 3-1和3-2。 过滤后准备分析模块。为了减少消耗品，使用步骤1.5.4.1和1.5.4.3相同尖集。 采取50微升的提示和吸取滤液至DWP的10微升等分试样（1：100稀释）对葡萄糖的测定（葡萄糖消耗）。 吸移管35微升滤液至平衡凝胶过滤板的中心和50μl到一个用于沉淀的MTP中。 重复步骤1.5.4.1 1.5.4.2到了第二个过滤板。 移动至凝胶过滤板至离心机并从工作台移动所有其它板返回到转盘基准位置。 重复步骤1.5.3.1到1.5.4.4对于第三和第四滤板。 存储所有板材的背面在转盘注意一下高粘性上清液，通过在过滤板残差所示（高V后面在过滤步骤后iscosity控制）。缺乏滤液可导致在以下分析模块假阴性结果。 通过96孔凝胶过滤的葡萄糖除去（任务3中图1） 离心凝胶过滤板在1000 xg离心20℃2分钟。 通过机械臂准备工作台处理凝胶滤液。 提供从转盘（5-3和5-4）50微升提示，WTP 3-3和3-4。 对凝胶过滤后剩余的葡萄糖测定移动两根台胞证自CP 9-1,9-2到WTP 4-1和5-1。 对于苯酚 – 硫酸 – 硫酸法提出两项台胞证由CP 8-5和8-6到4-2的WTP和5-2。 从离心机传送两层凝胶过滤板至WTP（4-3和5-3）。 解除从集电板（4-3和5-3）的凝胶过滤板和移动它们至WTP 3-1和3-2。 通过机械臂准备工作台处理凝胶滤液。 注意：为了减少耗材，使用同样的技巧，设置步骤1.6.3.1 1.6.3.2和。 为了检测凝胶过滤（1:10稀释）后剩余的葡萄糖取50微升的技巧和25微升的DDH 2 O（WTP 1-1）转移到一个新的中期计划。 DDH 2 O的吸的20微升（WTP 1-1），5微升空气和5微升凝胶滤液，分装到同一板块。 对于苯酚 – 硫酸酸法吸管20微升凝胶滤液中期计划。 重复步骤1.6.3.1和1.6.3.2对于第二凝胶滤液板。 从工作台传输所有板块回到他们的传送带上的基准位置。 重复这些步骤1.6.2.1到1.6.3.4对于第三和第四凝胶过滤板。 葡萄糖检测模块通过机械臂准备工作台进行葡萄糖作为说。 从CP 4-1和4-4到5-1的WTP和5-4：重新定位DWP（100稀释1）。 将所有台胞证由CP 9-5和9-8到4-1的WTP和4-4。 以200微升技巧和吸液和分配的180微升十倍体积混合稀释。然后吸取50微升等分的中期计划。 重复步骤对所有四个DWPs 1.7.1.2和1.7.1.3（1：100稀释）。 取下工作台所有DWPs（5-1到5-4）。 准备工作台开始葡萄糖的测定。 对于其余的葡萄糖凝胶过滤转让从CP所有台胞证（9-1到9-4），以WTP（5-1到5-4）后的决心。 移动至葡萄糖的测定校正板 – 含有三次加入50μl下列葡萄糖浓度的（90，45，18，第9，4.5，1.8，0.9，0.45和0毫克/升） – 自CP 9-9至WTP 3- 3。 以200微升技巧和抽吸与W葡萄糖检测试剂混合的50微升TP 1-2，将启动首次试验。移动至中期计划进入培养箱（30℃以150rpm进行30分钟）。 设定的时间表与在板之间5分钟的延迟启动程序。 孵育30分钟后移动板从孵化器到MTP阅读器和记录吸光度在418和480纳米。 测量后移动板在旋转木马的位置。 降水的制备注意：为了评估所述EPS生产之前和第一过滤步骤之后执行用2-丙醇上清的沉淀。此外，通过在第一纤维和薄片的观察评估在过滤器膜的聚合物的吸附，但不是在第二沉淀。 注意：处理2-丙醇为易燃液体严格按照通风橱中。 删除所有沉淀板（CP 6-1到6-4和8-1到8-4）从传送带上。并添加手动加入150μl2-丙醇至每孔用12.5毫升多步移液管。 覆盖有硅帽垫所有中期计划，并在室温（RT）（以900rpm 10分钟）摇动。晃动，表明EPS生产后，目视观察纤维或片状形态。 苯酚 – 硫酸 – 硫酸法注意：处理浓硫酸酸和苯酚在通风橱内。苯酚是一种腐蚀性和诱变剂。 对于苯酚 – 硫酸 – 硫酸法，从传送带上取下板（CP 8-5到8-8），并将它们放到液体处理系统（位置4-8）。包括用20微升不同葡萄糖浓度的校准板（10; 5; 2.5; 1; 0.5; 0.25; 0.1; 0.05 0克/升）在一式三份。 放置一个废物容器在位置1，在2位200微升尖端框和250毫升槽用110毫升苯酚-硫酸-酸（在冰上with18.3毫升苯酚新鲜制备的5％（重量/体积）的DDH 2 O的91.7毫升浓：Sulfuric酸）在3位。 使用用300μl提示一个8通道移液器和转移180微升酚 – 硫酸酸成的所有板的每一行。 覆盖所有台胞证用盖子，通过摇动（以900rpm，室温下5分钟）将它们混合，并在显色反应烘箱中在80℃下孵育他们35分钟。在通风橱下冷却后，测量在480nm处的消光。 车正上清液的选择（任务4在图1） EPS的生产的评价，选择从自动筛选该履行的至少两个的三个标准为阳性（粘度控制2.6.1和2.6.2，检测聚合物2.6.3，葡萄糖当量2.6.5）的那些菌株。传送从正命中剩余的滤液，以供进一步处理新的MTP中。 注意：当所述板覆盖有可以将它们保存在-20℃下至少一周的铝密封膜。内的时间的Determina的需要被执行的碳水化合物指纹的灰。 2.碳水化合物指纹注意：手动执行对碳水化合物指纹的所有步骤。 （ 图1中任务5）的正的上清液的凝胶过滤注：凝胶过滤是必要的，因为没有滤液从自动筛选左边。凝胶过滤用的降低净化效率超过35微升结果的量。 通过经由12.5毫升多步移液管分配150μl的乙酸铵缓冲液中至所有孔准备凝胶过滤板的平衡。 传送凝胶过滤板放入离心机（2000 xg离心2分钟，在20℃）。 重复步骤2.1.1，2.1.2和2.1.1再次。离心凝胶过滤板在1000 xg离心20℃在进一步使用前2分钟。 吸取35微升滤液进入凝胶过滤板的使用12通道50微升吸管的中心。 离心凝胶过滤板在1000 xg离心2分钟，在20℃，然后从集电板抬起。 水解前制备葡萄糖的测定：通过添加DDH 2 O的45和5μl凝胶滤液用12通道50微升吸管执行1:10稀释并覆盖用硅酮帽垫的台胞证。 注意：对于该聚合物的葡萄糖值的正确的确定，测量水解前的葡萄糖含量和从水解步骤后定量葡萄糖含量减去它。 水解前准备丙酮酸测定：采用了12通道200微升吸管95微升的DDH 2 O的，转让5微升凝胶滤液加入到每口井进行1:20稀释，并用密封硅盖垫片的MTP 。 96孔微水解（任务6在图1中） 注：烧热温育烤箱（包括沙浴），以121℃至少1.5小时，使用前。一个特殊的夹紧装置的开发是为了避免在中小型水解步骤的蒸发。 取一个新的PCR板和转移20微升凝胶滤液用12通道50微升吸管。 注意：三氟乙酸是腐蚀性酸和毒性。铵溶液具有腐蚀性。同时处理化学品只在通风橱中。 加入20μl的4M的三氟乙酸与1.25毫升多步移液管至每个孔。然后覆盖的PCR板与热塑性弹性体（TPE）帽垫，并放置在PCR板中的特殊夹紧装置。 经由反相夹紧装置十倍混合溶液。放在一个离心机和自旋将PCR板在2000×g离心2分钟以收集所有底部的液体。把PCR的板回夹紧装置并用螺丝固定在设备上。 放置在预加热的砂浴中担保夹紧装置和孵育在121℃90分钟。 从沙浴中取出夹紧装置，让它冷却下来RT。 卸下螺钉并再次在离心机中以2000 xg离心，以便收集在孔的底部的所有冷凝旋转2分钟，以防止除去帽垫的过程中交叉污染。 添加3.2％的氨水溶液将pH调节至大约8使用12通道200微升吸管。覆盖PCR板用TPE盖垫和用夹紧装置手动摇晃。 中和后离心PCR的板在2000 xg离心2分钟。 高通量-1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（ 图1中的任务7）碳水化合物（HT-PMP）-derivatization 转移25微升中和的水解产物中一个新鲜的PCR板使用12通道50微升吸管。 注意：取试样后，检查neutr经由与1.25毫升多步骤移液器加入12.5微升酚红指示剂（在5ml 20％乙醇0.05克酚红）中的水解板剩余液体虚拟。不变成粉红色（pH 8）中所有的孔不正确衍生化。 添加75微升衍生试剂混合（125毫克PMP 7毫升甲醇，3.06毫升DDH 2 O的，和438微升3.2％的硫酸铵溶液）并盖上一个TPE帽垫板。 在2000 XG在夹紧装置离心机在板摇晃的PCR板后2分钟以积累在底部的所有液体。 用于衍生化的地方将PCR板在PCR-循环仪在70℃下为100分钟，随后冷却至20℃。 使用12通道50微升吸管转移20微升等分试样到新的MTP中。然后用一个12通道200微升吸管并添加130微升19.23毫乙酸（0.962毫升1M乙酸+49.038毫升DDH 2 O的）到每一行。直接通过aspirat混合ING和分配（最少6次）和所有的液体，具有MTP集电板转移到一个0.2微米的过滤器板。 离心机的板（1,000×g离心5分钟），取出过滤板，密封件用硅酮帽垫的MTP和放置MTP入UHPLC-UV-ESI-MS为碳水化合物指纹14的确定。 的葡萄糖测定法的准备通过加入DDH 2 O的45微升和使用12通道50微升吸管5微升中和的水解产物进行1:10稀释并覆盖用硅酮帽垫的台胞证。添加三次加入50μl的不同葡萄糖标准（500，250，100，50，25，10，5，2.5和0μM）至用于校准一个新的MTP中。 添加使用12通道50微升吸管葡萄糖测定试剂混合（配方step1.2.3）的50微升。然后盖上硅帽垫的平板上，在30℃和400rpm的转速在一个MTP培养箱30分钟孵育。 <li>孵育后直接使在一个MTP阅读器在一个MTP-读数器在418和480nm处读取吸光度。用于葡萄糖浓度的计算执行线性校正在步骤2.6.4进行。 在丙酮酸法的制备使用12通道200微升吸管执行1:20稀释。添加95微升DDH 2 O的和中和的水解产物转移5μl的每个孔中。盖上盖子硅垫MTP。 加入100μl丙酮酸测定试剂混合（3毫升1mM的的N – （羧甲基氨基羰基）-4.4'双（二甲氨基） -二苯胺钠盐（DA-64），300微升10毫焦磷酸硫胺素，60微升100毫氯化镁六水合物，2.4毫升500mM的磷酸钾河豚（pH为5.7），30微升100单位丙酮酸氧化酶，12微升1000ù辣根过氧化物酶，并使用一个12信道200微升吸管24.19毫升DDH 2 O的）。 盖上盖子硅垫上板次在37℃和150rpm下进行30分钟孵育。直接后727和540 nm的在MTP阅读器孵化测定吸光度。 该自动筛选和碳水化合物指纹的所有结果评价。 注意到，展会的主要培养板已经离心分离并储存回转盘（粘度控制步骤1.4.1）下降后，这些沉淀样本。样品不显示沉淀形成为正（用于自动化的筛选准则1）。 注意到高粘性上清液，这是由残差在过滤板的过滤步骤（高粘度控制步骤1.5.4.6）之后指示的。缺乏滤液可导致假阴性结果在以下分析模块。即保持培养上清液在过滤井样品是正的（也是标准1自动筛选）。 直观地观察培养后的纤维或片状的形成。记笔记为TH就是指多糖。请评价无沉淀（ – ）;纤维或薄片的低沉淀用（+）和具有高沉淀（++）。此外，在第一经纤维和薄片的观察检测过滤器上的膜的聚合物的吸附，但不是在第二沉淀（标准2为自动筛选）。 用于葡萄糖浓度的计算执行线性校正。 请点击此处查看这个方程的放大版本。 执行5至0.1克/升葡萄糖的线性校准（吸收过浓度）。葡萄糖相当于水解聚合物的计算和下面的参数评价：葡萄糖等价的：> 700毫克/升=阳性; 300-700毫克/升=推定阳性; <300毫克/ L =阴性EPS格式方面离子（用于自动化的筛选准则3）。 请点击此处查看这个方程的放大版本。 量化与HT-PMP法测定所有的碳水化合物。总结所有的数量和评估如下：> 300毫克/升（阳性）; 150-300毫克/升（推定的正）和<150毫克/升（负）。 对于丙酮酸浓度的计算执行线性校正（100，50，25，10，5，2.5％，1，0.5和0μM）。为了排除在上清液中余下的丙酮酸，纠正经水解之前丙酮酸含量水解后丙酮酸含量。 请点击此处查看该方程组的一台放大版离子。