جيل من المستحثة متعددة القدرات الخلايا الجذعية من الإنسان الطرفية T الخلايا باستخدام سينداي الفيروسات في ظروف خالية من الطاعم
Summary
This protocol describes how to generate induced pluripotent stem cells (iPSCs) from human peripheral T cells in feeder-free conditions using a combination of matrigel and Sendai virus vectors containing reprogramming factors.
Abstract
في الآونة الأخيرة، جذبت iPSCs الاهتمام باعتبارها مصدرا جديدا من الخلايا للعلاجات التجدد. على الرغم من أن طريقة الأولي لiPSCs توليد تعتمد على الخلايا الليفية الجلدية التي حصلت عليها خزعة الغازية والإدراج الجيني فيروسات من الجينات المحورة، كان هناك الكثير من الجهود لتجنب هذه العيوب. خلايا T الطرفية البشرية هي مصدر الخلايا فريدة من نوعها لتوليد iPSCs. iPSCs المستمدة من الخلايا T تحتوي على إعادة ترتيب للمستقبلات الخلايا T (TCR) الجينات وتشكل مصدرا للخلايا T مستضد معين. بالإضافة إلى ذلك، T مستقبلات الخلية إعادة ترتيب في الجينوم لديه القدرة على تسمية خطوط الخلايا الفردية والتمييز بين الخلايا المزروعة والجهات المانحة. لالتطبيق السريري الآمن للiPSCs، فمن المهم للحد من خطر تعريض iPSCs ولدت حديثا لعوامل ضارة. على الرغم من خلايا الدم وتغذية الأبقار الجنين كانت ضرورية لزراعة الخلايا الجذعية المحفزة، فمن الأفضل لإخراجها من النظام الثقافة للحد من مخاطرالمرضية لا يمكن التنبؤ بها. ولمعالجة ذلك، أنشأنا بروتوكول لتوليد iPSCs من خلايا T الطرفية البشرية باستخدام فيروس سينداي للحد من خطر تعريض iPSCs لمسببات الأمراض غير محددة. على الرغم من أن التعامل مع فيروس سينداي تتطلب معدات مع المستوى المناسب للسلامة الأحيائية، سينداي يصيب فيروس تنشيط خلايا T دون الجينوم الإدراج، ولكن مع كفاءة عالية. في هذا البروتوكول، علينا أن نظهر توليد iPSCs من خلايا T الطرفية الإنسان في ظروف خالية من وحدة التغذية باستخدام مزيج من تنشيط زراعة الخلايا T وفيروس سينداي.
Introduction
جذبت iPSCs اهتماما كبيرا كمصدر رائد الخلايا الطب التجديدي 1-3. حتى الآن، تم الإبلاغ عن وسائل متنوعة لتوليد iPSCs 4،5. ومن بين هؤلاء، كان iPSCs المتولدة من خلايا T الإنسان أهمية خاصة نظرا للطريقة أقل الغازية من الخلايا أخذ العينات 6-8. بالإضافة إلى ذلك، iPSCs المستمدة من الخلايا T تحتوي على إعادة ترتيب للمستقبلات الخلايا T (TCR) الجين وبالتالي فهي مصدر للخلايا T مستضد معين 9،10. لذلك، وتوليد خلايا T المستمدة iPSCs مفيد للتقدم الطب التجديدي بأمان.
ويستند هذا الأسلوب على مفهوم الحد من مخاطر المرضية لا يمكن التنبؤ بها. لالتطبيق السريري الآمن للiPSCs من المهم للحد من مخاطر التعرض لمسببات الأمراض (11). سابقا في العديد من النظم الثقافة من الخلايا الجذعية المحفزة، وقد استخدمت خلايا الدم وتغذية الأبقار الجنينية، وكاشف أساسيق 12. ومع ذلك، وإزالة كل من هذه الكواشف من النظام الثقافة هي المفضلة لتوليد التوجيهية للحد من خطر الإصابة المرضية لا يمكن التنبؤ بها.
بالإضافة إلى ذلك، فإن هذا الأسلوب له ميزة تجنب أخذ عينات الخلايا الغازية من المرضى وإعداد شاقة من الخلايا المغذية. لأنه قد تم بالفعل استخدام الخلايا التائية iPSCs المستمدة بنجاح في بحوث الأمراض 13،14، وهذا الأسلوب هو المعمول بها ومفيدة لتوليد iPSCs بأمراض محددة من المرضى أيضا.
بين T أساليب إعادة برمجة الخلايا، وذلك باستخدام فيروس سينداي (SEV) ناقلات كوسيلة الجينات هي الطريقة التي يمكن أن تولد iPSCs بكفاءة عالية 7،16. بالإضافة إلى ذلك، لأن SEV هو فيروس RNA واحد الذين تقطعت بهم السبل ولا يحتاج إلى مرحلة DNA للنسخ المتماثل، واستخدامه في توليد التوجيهية يتجنب كسر الجينوم المضيف 17-19. لذلك، أنشأنا بروتوكولات لتوليد iPSCs من خلايا T الطرفية الإنسان في المصل الابه ه وظروف خالية من وحدة التغذية باستخدام مزيج من matrigel، mTeSR المتوسطة، وSEV ناقلات.
Protocol
Representative Results
Discussion
We describe a protocol for generating iPSCs from human peripheral T cells in serum-free and feeder-free conditions using a combination of matrigel, mTeSR medium, and SeV vectors. For clinical applications of iPSCs, it is important to have a protocol for stably generating iPSCs and a less-invasive method for cell sampling. Although generating iPSCs with the combination of matrigel and mTeSR medium showed lower reprogramming efficiency than that with knockout serum replacement (KSR) medium and feeder-cells, this combination achieves stable generation of iPSCs from donors16. Stable iPSC generation and less-invasive cell sampling has the advantage of being able to increase the number of donors for iPSC generation.
SeV vectors, a minus-strand RNA virus, is not integrated into the host genome. Therefore the risks of tumorigenesis can be avoided at the step of reprogramming factor induction20-24. Additionally, the feeder-free conditions, which use a combination of defined culture medium and matrigel instead of a feeder layer, make it possible to minimize the potential risks of exposure to unknown exogenous factors. The fusion of these techniques provides a less invasive and safer iPSC technology for regenerative medicine16.
Important steps in this protocol are the step of activating human T cells (Step 1) and infecting them with SeV vectors (Step 2). When no ESC-like colony is obtained in the culture dish at an optimal time after SeV infection, the following should be considered. First, the confluency of the mononuclear cells before T cell activation may not be appropriate because optimal activation of T cells is critical for SeV infection25,26. Too high a density of mononuclear cells leads to cell death, interfering with the proper activation of T cells. Too low a density of mononuclear cells also disturbs the proper activation and proliferation of T cells. Therefore, the confluency of mononuclear cells should be checked and adjusted accordingly. Second, the dosage of SeV vectors may not be sufficient. The induction efficiency of iPSC colonies depends on the dosage of the virus6. If no ESC-like colony is observed after SeV infection, the option of increasing the virus dosage up to an MOI of 15-20 should be considered. If signs of iPSC colony differentiation are observed, the frequency at which medium is changed may be increased up to every other day, or to every day when colonies are larger.
The limitation in this protocol consists of this method not being virus free. Although SeV for cell reprogramming is commercially available with ease, users need to prepare equipment according to the appropriate biosafety level. As another method for generating integration-free iPSCs, episomal vectors have been used until now27-29. Although episomal vectors can be used with equipment with a lower level of biosafety, episomal vectors might insert into the host genome at extremely low rates. Therefore, additional checks are required to confirm the disappearance of transgenes, as when using SeV.
There is another limitation in that this technique is not absolutely free from animal-derived products. Some substrates, such as matrigel, anti-CD3 mAb, dissociation solution and SeV solution are derived from animal products and are therefore associated with a risk of transferring xenogeneic pathogens. However, the reduction of animal-derived substrates in the culture system is meaningful for the clinical application of iPSC technology due to the lower risk.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر يوشيكو مياكي، ساياكا Kanaami، شيهانا فوجيتا، ميهو ياماغوتشي، ناتسوكو Henmi، وري اونو من كلية الطب بجامعة كيو للحصول على المساعدة الفنية. وقد تم تمويل هذا العمل جزئيا من خلال برنامج R & D أنظمة الدعم لتسريع استخدام العملي لنتائج البحوث الصحية، وبرنامج الطريق السريع للتحقيق للطب التجديدي.
Materials
| Ficoll-Paque PREMIUM | GE Healthcare | 17-5442-02 | |
| Purified NA/LE mouse anti-human CD3 | BD Pharmingen | 555336 | |
| KBM502 medium | KOHJIN BIO | 16025020 | Warm in 37 ℃ water bath before use |
| Bovine albumin fraction V solution | Gibco | 15260-037 | |
| BD Matrigel Matrix Growth Factor Reduced | BD Biosciences | 354230 | Thaw completely at 4℃ overnight and dilute it 50 times with Dulbecco's Modified Eagle's Medium before coating culture dishes |
| mTeSR1 medium kit | STEM CELL | 5850 | Warm at room temperature before use |
| Dissociation Solution | ReproCELL | RCHETP002 | |
| D-PBS(–) | Wako | 045-29795 | |
| SeV Vector kit CytoTune-iPS ver.1.0 | DNAVEC | DV-0303c | Thaw on ice before use |
| 100-mm tissue culture dish | Falcon | 353003 | |
| 96-well tissue culture plate | Falcon | 353078 | |
| 6-well tissue culture plate | Falcon | 353046 | |
| 15ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 188271 | |
| 50ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 227261 |
Referências
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Hayes, M., Zavazava, N. Strategies to generate induced pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. 1029, 77-92 (2013).
- Gonzalez, F., Boue, S., Izpisua Belmonte, J. C. Methods for making induced pluripotent stem cells: reprogramming a la carte. Nat Rev Genet. 12, 231-242 (2011).
- Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
- Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).
- Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12, 114-126 (2013).
- Vizcardo, R., et al. Regeneration of Human Tumor Antigen-Specific T Cells from iPSCs Derived from Mature CD8 T Cells. Cell Stem Cell. 12, 31-36 (2013).
- Sampsell-Barron, T. Xeno-free adaptation and culture of human pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. 1001, 81-97 (2013).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Minegishi, Y., et al. Enhanced optineurin E50K-TBK1 interaction evokes protein insolubility and initiates familial primary open-angle glaucoma. Hum Mol Genet. 22, 3559-353367 (2013).
- Tanaka, A., et al. Endothelin-1 induces myofibrillar disarray and contractile vector variability in hypertrophic cardiomyopathy-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. J Am Heart Assoc. 3, e001263 (2014).
- Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24, 185-187 (2006).
- Kishino, Y., et al. Derivation of transgene-free human induced pluripotent stem cells from human peripheral T cells in defined culture conditions. PLoS One. 9, e97397 (2014).
- Masaki, I., et al. Recombinant Sendai virus-mediated gene transfer to vasculature: a new class of efficient gene transfer vector to the vascular system. FASEB J. 15, 1294-1296 (2001).
- Li, H. O., et al. A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression. J Virol. 74, 6564-6569 (2000).
- Ikeda, Y., et al. Recombinant Sendai virus-mediated gene transfer into adult rat retinal tissue: efficient gene transfer by brief exposure. Exp Eye Res. 75, 39-48 (2002).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).
- Macarthur, C. C., et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells by a nonintegrating RNA Sendai virus vector in feeder-free or xeno-free conditions. Stem cells Int. , 564612 (2012).
- Iida, A. Sendai virus vector: vector development and its application to health care and biotechnology. Uirusu. 57, 29-36 (2007).
- Yoshida, K., et al. In vivo repopulation of cytoplasmically gene transferred hematopoietic cells by temperature-sensitive mutant of recombinant Sendai viral vector. Biochem Biophys Res Comm. 361, 811-816 (2007).
- Bitzer, M., Armeanu, S., Lauer, U. M., Neubert, W. J. Sendai virus vectors as an emerging negative-strand RNA viral vector system. J Gene Med. 5, 543-553 (2003).
- Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus. Nat Protoc. 7, 718-728 (2012).
- Okano, S., et al. Recombinant Sendai virus vectors for activated T lymphocytes. Gene Ther. 10, 1381-1391 (2003).
- Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31 (3), 458-466 (2013).
- Zhang, X. B. Cellular reprogramming of human peripheral blood cells. Genom Proteom Bioinform. 11 (5), 264-274 (2013).
- Su, R. J., Neises, A., Zhang, X. B. Generation of iPS Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors. Methods Mol Biol. , (2014).
