Использование изолированными митохондриями из минимальных количествах мыши скелетных мышц для Высокая пропускная MICROPLATE респираторных измерений
Summary
The methods presented provide step-by-step instructions for the performance of a collection of microplate based respirometric assays using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle. These assays are able to measure mechanistic changes/adaptations in mitochondrial oxygen consumption in a commonly used animal model.
Abstract
Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of mitochondrial function in this tissue has become more prevalent. Although many technologies and assays exist that measure mitochondrial respiratory pathways in a variety of cells, tissue and species, there is currently a void in the literature in regards to the compilation of these assays using isolated mitochondria from mouse skeletal muscle for use in microplate based technologies. Importantly, the use of microplate based respirometric assays is growing among mitochondrial biologists as it allows for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. Therefore, a collection of microplate based respirometric assays were developed that are able to assess mechanistic changes/adaptations in oxygen consumption in a commonly used animal model. The methods presented herein provide step-by-step instructions to perform these assays with an optimal amount of mitochondrial protein and reagents, and high precision as evidenced by the minimal variance across the dynamic range of each assay.
Introduction
Основная физиологическая роль скелетных мышц митохондриями является производство АТФ из окислительного фосфорилирования 1. Важно отметить, что скелетные мышцы митохондрий играть определенную роль в физической нагрузки 2, 3 старения, дегенеративные заболевания 4 и Type II диабетом 5. Как стареющем обществе, и типа диабета II, являющегося 7-й ведущей причиной смерти в Соединенных Штатах 6, потребность в способах, которые оценивают функции митохондрий становится все более более распространены в биомедицинских исследованиях 7,8. В частности, измерение потребления кислорода имеет исключительную полезность в оценке функции митохондрий, так как она представляет собой скоординированную функцию между митохондриальных геномов и ядерных выразить функциональные компоненты окислительного фосфорилирования 9.
Несколько существуют технологии, позволяют измерение потребления кислорода в интактных клетках и изолироватьD митохондрии 7-10. Кроме того, анализы были разработаны для различных типов клеток и тканей, а также в различных видов, которые позволяют для измерения митохондриальных дыхательных путей и контроля 9,11,12. Тем не менее, в настоящее время существует пробел в литературе в отношении составления всех этих анализов с использованием изолированного митохондрии от мыши скелетных мышц для использования в микропланшета технологии потребления кислорода. Важно отметить, что использование микропланшетов основе respirometric анализов растет среди митохондриальных биологов и позволяет высоких измерений пропускной используя минимальные количества изолированными митохондриями 9. Таким образом, коллекция микропланшета на основе анализов respirometric были разработаны, которые позволяют выявлением, где аномалии и / или адаптации может происходить в электронно-транспортной цепи (ETC). Кроме того, предусмотрены две дополнительные микропланшет, основанные respirometric анализы были разработаны, которые позволяют оценку координации betweeп трикарбоновых кислот (ЦТК) цикл и т.д., и между бета-окисления и Т.Д. Важно отметить, что представленные методы обеспечивают четкое и краткое способ измерения механистические изменения в функции митохондрий в обычно используемой модели животного.
Protocol
Representative Results
Discussion
Методы, представленные в этой статье предоставить шаг за шагом инструкции для выполнения коллекции микропланшета на основе анализа с использованием respirometric митохондрии, выделенные из 75 – 100 мг мыши скелетных мышц. Эти анализы могут быть выполнены с высокой точностью, о чем свидетельствует плотный стандартное отклонение между трех лунок. Важно, что эти анализы позволяют respirometric выявлении, где нарушения и / или адаптации может происходить в т.д., ЦТК, β-окисления токопровод, подложка транспортеры, и т.д., в обычно используемом животной модели.
Это важно подчеркнуть, обоснование использования различных видов топлива и ингибиторы, используемые в настоящем протоколе. Пируват / малат и глутамат / малат respirometric анализы позволяют для оценки Комплекс I, опосредованного дыхания, а также при оценке их соответствующих транспортеров, и в случае глутамат, в Аденозиндеминазный 15. Кроме того, сочетаниесукцинат / ротенон позволяет оценить митохондриальной дыхательной потока через комплекс II в ЕТС, так ротенон ингибирует комплекс I и сукцинат обеспечивает электроны комплекса II с помощью сокращения флавинадениндинуклеотид (FADH 2) 15. Эти анализы обеспечивают подложку конкретную информацию об эффективности связи и максимальной дыхания. Анализ электронный поток является уникальным в том, что сочетание подложки и ингибиторов позволяет оценить нескольких комплексов во митохондриальной дыхательной потока 9. Начальная смесь субстрат пирувата / малат + FCCP позволяет для оценки максимального дыхания обусловлен комплекс I, в то время как инъекции ротенона последующим сукцината позволяет оценка максимального дыхания обусловлен комплексом II. Инъекция антимицина А, ингибитор комплекса III, с последующим введением аскорбиновой кислоты / TMPD позволить для оценки дыхания обусловлен комплекса IV, так как аскорбат / TMPD являетсядонора электронов для цитохрома С / комплекса IV. В то время как нет информации об эффективности связи не получается, метод идеально подходит для очень малых размеров выборки, которые исключают запуска нескольких подложек самостоятельно. Наконец, использование пальмитоил карнитина / малат позволяет оценить координации между -окисления и т.д. с восстанавливающим эквивалента от окисления пальмитиновой кислоты (бета-окисления) подается в ETC через электрона передающей флавопротеид 15. Следует отметить, что поток пробы Сцепление и Electron также могут быть использованы в сочетании, чтобы идентифицировать изменения в функции митохондрий из-за некоторого вмешательства (лечения препарат, генетической манипуляции).
Высокая точность достигается для этих анализов, прежде всего, из-за тщательного перемешивания митохондрий, является ли это до определения белка, или с решениями подложки. Вдоль этих линий, как только митохондрии resuspendend в подложке SOLUTIOнс, важно, чтобы смешать это решение тщательно перед загрузкой культуру пластину клеток, как описано в шаге 2.2 с расширенной отверстие наконечника пипетки. Отказ смешивать митохондрии тщательно приведет к большим изменением в анализе. Кроме того, с помощью узкой пипетки отверстия создаст силы сдвига при смешивании митохондрии и увеличивает потенциал, чтобы повредить митохондриальных мембран и высвобождение цитохрома С. шаг соблюдение (2.7) также является важным шагом в этом протоколе. Отказ вращаться загруженный клеточной культуры пластину длинный / достаточно быстро приведет к неполной приверженности митохондрий в скважину, что приводит повышенной изменчивости между скважинами и измерений.
Описанный протокол был оптимизирован для включают в себя: загрузка оптимальное количество белка митохондрий на лунку, используя правильные концентраций / методы подготовки, чтобы сделать акции и подложки решения, изменения анализа бежать, чтобы обеспечить митохондриальной государственной плаteaus, и целесообразно смешивание митохондриальных фондовых и митохондриальной / подложки смесей. До этих усилий по оптимизации, авторы столкнулись ловушек в аналитическом счете. Ниже обсуждаются способы устранения неполадок / модификации, которые были полезны в оптимизации этого протокола. Что касается оптимальной загрузки, загрузка слишком мало митохондрий не вызовет надежную реакцию, при загрузке слишком много митохондрий исчерпает кислород в микрокамеры и привести к неточным измерениям. Роджерс и др 9 приведены примеры определения оптимальных объемов погрузки митохондрий на лунку для микропланшетов основе respirometric анализов. Чаще слишком много митохондрий загружен в также свидетельствует состоянии 2 ставки в течение 100-200 пмоль / мин / хорошо и состояние 3 ставки> 1500 пмоль / мин / лунку. Если в течение погрузка осуществляется, провести эксперимент с различной концентрацией митохондрий белка (например, между 1 -. 10 мкг), чтобы вызвать OCRs в пределах динамического гAnge измерительной машины потребления кислорода. Подготовка и использование правильных концентраций субстратов и запасов имеет первостепенное значение. Всегда использовать кислотную форму субстратов / инъекций и доведения рН с гидроксидом калия или HCl; буферы натрия / решения не рекомендуется. Кроме того, ресуспендированием субстраты / запасы в ДМСО или 100% этанола приведет к повреждению измерительного или ошибок. Будьте уверены, чтобы использовать 95% этанол где отмечено. Она является общей для пальмитоил карнитина для осаждения из 95% этанола после оттаивания замороженного акции, тем самым вызывая большой изменчивостью. Будьте уверены, чтобы разогреть пальмитоил карнитина акции и вихрь хорошо перед использованием. Кроме того, сильно варьирует пируват / малат результат анализа может быть связано с пируват фондовой существа> 2 недель. Будьте уверены, чтобы переделать замороженные аликвоты пирувата каждые 2 недели. Анализ выполнения был изменен, чтобы измерения 2-минутных обеспечить митохондриальных государственные плато. Если наблюдение истощения АДФ желательно, исследователь можетпродлить время измерения на вкладке «Протокол» в рамках проекта «Мастер анализа" форума. Наконец, большая изменчивость возникает, когда митохондриальной фондовые и митохондрий плюс подложки решения не гомогенизировали полностью до погрузки. Если изменчивость между скважинами высокая после анализа перспективе, убедитесь, что в полной мере смешивания раствора субстрата до следующего эксперимента. Никогда вихрь решения митохондрии / подложки, а перемешать, пюре и аккуратно растирать с расширенной отверстие наконечника пипетки.
Есть некоторые ограничения этого метода, которые стоит отметить. Во-первых, количество скважин на культуральный планшет, используемый для этих анализов является относительно низким (т.е.., 24 скважин и, по меньшей мере 2, предназначенных для контрольных лунок). Если желательно, чтобы выполнить все 5 из этих анализов на одной пластине, исследователь может только рассмотреть ответы от одной мыши одновременно. Тем не менее, следует отметить, что 96-луночные инструменты для ВЫСОг пропускную способность. Во-вторых, есть сила и слабость в оценке дисфункцию митохондрий в изолированных митохондриях по сравнению с в интактных клетках 1. Некоторые недостатки включают наличие менее физиологическое значение по сравнению с интактными клетками и вызывающих артефакты из процесса выделения. Наконец, успех этого метода будет зависеть от качества процесса изоляции митохондрий.
Хотя некоторые из этих анализов были либо разработаны в различных системах или были подтверждены в других моделях на животных, методы, представленные здесь, являются первым, чтобы синтезировать все вышеупомянутые анализов для оптимального использования в нескольких хорошо измерение машина потребление кислорода с помощью мыши скелетная мышца. Важно отметить, что все 5 из этих анализов могут быть выполнены с количеством митохондрий, выделенных из ~ 75 – 100 мг мыши скелетных мышцах, обеспечивая тем самым высокую пропускную способность при минимальном материала. Большое значение, способность мульти-колодцатехнологии потребления кислорода для выполнения анализов с минимальными количествами митохондрий, в сочетании с оптимизированной методом изоляции, позволяет исследователю выполнять множество других экспериментов с остатком скелетной мышечной ткани (например,., западных пятна, ОТ-ПЦР, ферментативных анализы, и т.д.), который часто является борьба с этой модели на животных.
В заключение, методы, представленные в данном документе, шаг за шагом инструкции для выполнения коллекции микропланшета на основе анализа с использованием respirometric минимальные количества мыши скелетных мышц. Важно отметить, что представленные методы требуют минимальных количеств ткани и митохондрий. После освоено, описанные здесь позволит исследователям определить потенциальный механизм соединения или генного продукта в митохондриальной потребления кислорода в обычно используемом животной модели.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The Fralin Life Science Research Institute and The Metabolic Phenotyping Core at Virginia Tech supported this work.
Materials
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | Store at room temperature |
| D-Mannitol | Sigma Aldrich | 63559 | Store at room temperature |
| Potassium phosphate monobasic, minimum 99.0% | Sigma Aldrich | P5379 | Store at room temperature |
| Magnesium chloride hexahydrate, ACS reagent, 99.0-102.0% | Sigma Aldrich | M9272 | Store at room temperature |
| HEPES minimum 99.5% titration | Sigma Aldrich | H3375 | Store at room temperature |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | Store at room temperature |
| Essentially Fatty | Sigma Aldrich | A6003 | Store at 4°C |
| Acid Free- BSA | |||
| Pyruvic Acid, 98% | Sigma Aldrich | 107360 | Store at 4°C |
| Succinic Acid | Sigma Aldrich | S9512 | Store at room temperature |
| L(-) Malic Acid, BioXtra, ≥95% | Sigma Aldrich | M6413 | Store at room temperature |
| L-Glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | Store at room temperature |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma Aldrich | T7394 | Store at room temperature |
| 99%, powder [TMPD] | |||
| Palmitoyl L-carnitine chloride | Sigma Aldrich | P1645 | Store at -20°C |
| Oligomycin A, ≥ 95% (HPLC) | Sigma Aldrich | 75351 | Store at -20°C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) | Sigma Aldrich | C2920 | Store at 2-8°C |
| phenylhydrazone | |||
| ≥98% (TLC), powder [FCCP] | |||
| Antimycin A from streptomyces sp. | Sigma Aldrich | A8674 | Store at -20°C |
| Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP] | Sigma Aldrich | A5285 | Store at -20°C |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | Store at room temperature |
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | N/A |
Referências
- Brand, M., Nicholls, D. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435, 297-312 (2011).
- Wang, H., Hiatt, W. R., Barstow, T. J., Brass, E. P. Relationships between muscle mitochondrial DNA content, mitochondrial enzyme activity and oxidative capacity in man: alterations with disease. European Journal of Applied Physiology and Occupational Physiology. 80, 22-27 (1999).
- Lauri, A., Pompilio, G., Capogrossi, M. C. The mitochondrial genome in aging and senescence. Ageing Research Reviews. 18C, 1-15 (2014).
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148, 1145-1159 (2012).
- Dube, J. J., et al. Effects of acute lipid overload on skeletal muscle insulin resistance, metabolic flexibility, and mitochondrial performance. Endocrinology and Metabolism. 307, E1117-E1124 (2014).
- Disease Control and Prevention Services. National diabetes statistics report: estimates of diabetes and its burden in the United States. , (2014).
- Guarino, R. D., et al. Method for determining oxygen consumption rates of static cultures from microplate measurements of pericellular dissolved oxygen concentration. Biotechnology and Bioengineering. 86, 775-787 (2004).
- Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes. Nature Protocols. 1, 2563-2572 (2007).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS One. 6, e21746 (2011).
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, C125-C136 (2007).
- Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells. Methods (San Diego, Calif.). 26, 292-297 (2002).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).
- Frisard, M. I., et al. Low levels of lipopolysaccharide modulate mitochondrial oxygen consumption in skeletal muscle. Metabolism. 64, 416-427 (2015).
- Chance, B., Williams, G. R. The respiratory chain and oxidative phosphorylation. Advances in Enzymology and Related Subjects of Biochemistry. 17, 65-134 (1956).
- Gnaiger, E. Mitochondrial pathways and respiratory control. , (2007).
