في المختبر جيل من الخلايا الجذعية من الفئران بلازماوية الشكل المشتركة اللمفاوية الأسلاف باستخدام نظام تغذية AC-6
Summary
In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.
Abstract
الخلايا الجذعية بلازماوية الشكل (pDCs) هي نوع قوي I إنترفيرون (IFN-I) المنتجة للخلايا التي يتم تفعيلها في الاستجابة للعدوى أو أثناء الاستجابات الالتهابية. للأسف، إن ما يعرقل دراسة وظيفة PDC بواسطة التردد المنخفض في الأجهزة اللمفاوية، والأساليب القائمة لفي المختبر الجيل DC يفضلون في الغالب إنتاج جان تنمية المجتمعات المحلية على pDCs. هنا نقدم نهجا فريدا لتوليد بكفاءة pDCs من الأسلاف اللمفاوية المشتركة (CLPs) في المختبر. على وجه التحديد، وصفت البروتوكول تفاصيل كيفية تنقية CLPs من نخاع العظام وتوليد pDCs التي كتبها coculturing مع AC-6 الخلايا المغذية-المشع γ في وجود Flt3 يجند. ومن الخصائص الفريدة لهذا النظام الثقافة هي أن CLPs تهاجر تحت الخلايا AC-6 وتصبح الخلايا المكونة للمنطقة حصوه، خطوة حاسمة لتوسيع pDCs. تم إنشاء البلدان النامية متميزة شكليا، وهي pDCs وجان تنمية المجتمعات المحلية، وبعد ما يقرب من 2 أسابيع مع تكوين 70-90٪ pDCs تحت الظروف المثلى. عادة، وعدد من pDCs التي تم إنشاؤها بواسطة هذا الأسلوب هو ما يقرب من 100 أضعاف عدد CLPs المصنفة. لذلك، هذا هو نظام الرواية التي لتوليد بقوة الأعداد الكبيرة من pDCs اللازمة لتسهيل إجراء المزيد من الدراسات في تطوير وظيفة هذه الخلايا.
Introduction
الخلايا الجذعية (DCS) هي خلايا العارضة للمستضد المهنية التي تلعب دورا هاما في السيطرة على الاستجابات المناعية 1. بينما البلدان النامية غير متجانسة، فإنها يمكن تصنيفها إلى قسمين السكان، البلدان النامية التقليدي (جان تنمية المجتمعات المحلية) والبلدان النامية بلازماوية الشكل (pDCs) 2،3. بالإضافة إلى الأجهزة اللمفاوية، تم العثور جان تنمية المجتمعات المحلية وpDCs أيضا في الأنسجة بما في ذلك الرئة والأمعاء، والجلد 2. مورفولوجية جان تنمية المجتمعات المحلية وpDCs يختلف، مع جان تنمية المجتمعات المحلية واظهار التوقعات تشبه التغصنات وشكل pDCs يجري مثل خلية المزيد من البلازما. بالإضافة إلى ذلك، الماوس المشترك DC علامة، CD11c و، وأعرب أكثر إلى حد كبير على جان تنمية المجتمعات المحلية من على pDCs. وعلاوة على ذلك، جان تنمية المجتمعات المحلية ويمكن تقسيمها الى مزيد من CD11b + CD24 – جان تنمية المجتمعات المحلية وCD11b – CD24 + جان تنمية المجتمعات المحلية، وكلاهما تعبير عن مستويات أعلى من الدرجة MHC II والجزيئات costimulatory من القيام pDCs 2. pDCs ناضجة، من ناحية أخرى، وقد ثبت للتعبير بشكل انتقائي Siglec-H وBST2 4. Functionally، جان تنمية المجتمعات المحلية والمستضد أفضل عرض الخلايا من هم pDCs. ومع ذلك، يمكن pDCs تنتج كمية هائلة من النوع الأول إنترفيرون على عدوى فيروس أو التحفيز التهابات 5.
كلا جان تنمية المجتمعات المحلية وpDCs وقصيرة الأمد، وبالتالي، يجب أن تتجدد باستمرار من الأسلاف في نخاع العظم (BM) 6،7. نقل بالتبني من الأسلاف المشتركة الدم النخاعي (CMPS) والأسلاف اللمفاوية المشتركة (CLPs) في الفئران قاتل المشع يوضح أن جان تنمية المجتمعات المحلية وpDCs يمكن أن تتولد من كل الأنساب 10/08. ومع ذلك، هناك مجموعة فرعية من pDCs التي تعبر عن RAG1 / 2 وتمتلك قطاعات DJ ترتيبها في موضع IGH 11،12. كما شارك هذه الخلايا الجزيئية التشابه مع الخلايا الليمفاوية B، بما في ذلك التعبير عن علامة B220، الاستشعار الحمض النووي مستقبلات (TLR7 / TLR9)، وعوامل النسخ (Spib وBcl11a) 13، ويضم كل يعتقد أن التوقيعات على النسب اللمفاوية. ولذلك، CLPالصورة قد تكون خيارات جيدة للجيل في المختبر من pDCs بسبب النسب التشابه.
في حين أن تردد كل من جان تنمية المجتمعات المحلية وpDCs في البشر والفئران منخفض جدا 6، البلدان النامية، ولا سيما جان تنمية المجتمعات المحلية، يمكن أن تتولد في المختبر من BM أو الأسلاف في حضور السيتوكينات، مثل GM-CSF 11،14 أو Flt3 يجند (FL ) باستخدام أنظمة خالية المغذية 11،15،16. لسوء الحظ، ومع ذلك، فإنه ليس من الممكن لإنتاج أعداد كبيرة من pDCs في المختبر باستخدام FL 11،15،16. سابقا أثبتنا أن pDCs يمكن أن تتولد بكفاءة في المختبر من CLPs باستخدام نظام AC-6 التغذية 17. وميزة استخدام خط الخلية انسجة AC-6 في نظام الثقافة هو أنه يوفر اتصال خلية خلية وإفراز السيتوكينات التي تدعم توليد أعداد كبيرة من pDCs من CLPs. على الرغم من أن الإنتاج مع هذا النظام قوي جدا، والنسخ دقيق للإجراءات المبينة أدناه مطلوب طالدرجة n لضمان جيل كفاءة pDCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن هنا وصف في المختبر نظام الثقافة للجيل قوي من البلدان النامية، وpDCs على وجه الخصوص، من عدد صغير من CLPs. ويرجع ذلك إلى استخدام AC-6 خلايا، خط خلية اللحمية، كما مغذيات تفرد هذا النظام الثقافة. وقد تبين هذا النهج لتوفير ليس فقط السيتوكينات، مثل IL-7، SCF، M-CSF وFL 20، ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون لالدكاترة. ماركوس مانز وايرفينغ ويسمان لتوفير الكواشف. نحن نعترف أيضا الخدمات التي يقدمها تدفق Cytometric تحليل والخلية مرفق الفرز الأساسية من الأول ومختبر الأساسية الثانية في كلية جامعة تايوان الوطنية مستشفى الطب وجامعة تايوان الوطنية، على التوالي. وأيد هذا العمل من قبل وزارة العلوم والتكنولوجيا، تايوان (MOST 102-2320-B-002-030-MY3) والمعاهد الوطنية للبحوث الصحية، تايوان (المؤسسة الوطنية-EX102-10256SI وطنية لحقوق الإنسان-EX103-10256SI).
Materials
| Anti-mouse Ly6g/Ly6c (PE), clone RB6-8C5 | Biolegend | 108408 | linage marker |
| Anti-mouse NK1.1 (PE), clone PK136 | Biolegend | 108708 | linage marker |
| Anti-mouse CD11b (PE), cloneM1/70 | Biolegend | 101208 | linage marker |
| Anti-mouse CD19 (PE), clone eBio1D3 | Biolegend | 115508 | linage marker |
| Anti-mouse B220 (PE), clone RA3-6B2 | Biolegend | 103208 | linage marker/FACS |
| Anti-mouse CD3 (PE), clone 17A2 | Biolegend | 100308 | linage marker |
| Anti-mouse CD8a (PE), clone 53-6.7 | Biolegend | 100707 | linage marker |
| Anti-mouse MHC-II (PE), clone NIMR-4 | Biolegend | 107608 | linage marker |
| Anti-mouse Ter119 (PE), clone TER-119 | Biolegend | 116208 | linage marker |
| Anti-mouse Thy1.1 (PE), clone HIS51 | eBioscience | 12-0900-83 | linage marker |
| Anti-mouse M-CSFR (APC), clone AFS98 | Biolegend | 135510 | FACS |
| Anti-mouse c-Kit (PerCP/Cy5.5), clone 2B8 | Biolegend | 105824 | FACS |
| Anti-mouse Sca-1 (FITC), clone D7 | Biolegend | 108106 | FACS |
| Anti-mouse IL-7Ra (PE/Cy7), clone A7R34 | Biolegend | 135014 | FACS |
| Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), clone N418 | Biolegend | 117328 | FACS |
| Anti-mouse CD11b (FITC), clone M1/70 | Biolegend | 101206 | FACS |
| FACSAria III | BD Biosciences | Cell sorter | |
| FACS sorting tube | BD Biosciences | 352054 | |
| FlowJo | FlowJo LLC | Flow analysis sofrware |
Referências
- Hartwig, C., et al. Fcgamma receptor-mediated antigen uptake by lung DC contributes to allergic airway hyper-responsiveness and inflammation. Eur. J. Immunol. 40, 1284-1295 (2010).
- Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annu. Rev. Immunol. 31, 563-604 (2013).
- Mildner, A., Jung, S. Development and Function of Dendritic Cell Subsets. Immunity. 40, 642-656 (2014).
- Swiecki, M., Colonna, M. Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance. Immunol. Rev. 234, 142-162 (2010).
- Liu, Y. J. IPC: professional type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors. Annu. Rev. Immunol. 23, 275-306 (2005).
- Merad, M., Manz, M. G. Dendritic cell homeostasis. Blood. 113, 3418-3427 (2009).
- Ghosh, H. S., Cisse, B., Bunin, A., Lewis, K. L., Reizis, B. Continuous expression of the transcription factor e2-2 maintains the cell fate of mature plasmacytoid dendritic cells. Immunity. 33, 905-916 (2010).
- Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo. J. Exp. Med. 198, 305-313 (2003).
- Manz, M. G., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L., Akashi, K. Dendritic cell potentials of early lymphoid and myeloid progenitors. Blood. 97, 3333-3341 (2001).
- D’Amico, A., Wu, L. The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3. J. Exp. Med. 198, 293-303 (2003).
- Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells. Blood. 121, 11-19 (2013).
- Shigematsu, H., et al. Plasmacytoid dendritic cells activate lymphoid-specific genetic programs irrespective of their cellular origin. Immunity. 21, 43-53 (2004).
- Reizis, B., Bunin, A., Ghosh, H. S., Lewis, K. L., Sisirak, V. Plasmacytoid dendritic cells: recent progress and open questions. Annu. Rev. Immunol. 29, 163-183 (2011).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J. Exp. Med. 176, 1693-1702 (1992).
- Naik, S. H., et al. Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo. Nat. Immunol. 8, 1217-1226 (2007).
- Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nat. Immunol. 8, 1207-1216 (2007).
- Chen, Y. L., et al. A type I IFN-Flt3 ligand axis augments plasmacytoid dendritic cell development from common lymphoid progenitors. J. Exp. Med. 210, 2515-2522 (2013).
- Whitlock, C. A., Tidmarsh, G. F., Muller-Sieburg, C., Weissman, I. L. Bone marrow stromal cell lines with lymphopoietic activity express high levels of a pre-B neoplasia-associated molecule. Cell. 48, 1009-1021 (1987).
- Onai, N., Obata-Onai, A., Tussiwand, R., Lanzavecchia, A., Manz, M. G. Activation of the Flt3 signal transduction cascade rescues and enhances type I interferon-producing and dendritic cell development. J. Exp. Med. 203, 227-238 (2006).
- Szilvassy, S. J., et al. Leukemia inhibitory factor upregulates cytokine expression by a murine stromal cell line enabling the maintenance of highly enriched competitive repopulating stem cells. Blood. 87, 4618-4628 (1996).
- Arcanjo, K., et al. Biochemical characterization of heparan sulfate derived from murine hemopoietic stromal cell lines: a bone marrow-derived cell line S17 and a fetal liver-derived cell line AFT024. J. Cell. Biochem. 87, 160-172 (2002).
- Onai, N., et al. A clonogenic progenitor with prominent plasmacytoid dendritic cell developmental potential. Immunity. 38, 943-957 (2013).
- Whitlock, C. A., Muller-Sieburg, C. E. Long-term B-lymphoid cultures from murine bone marrow establishment and cloning by using stromal cell line AC 6.21. Methods Mol. Biol. 75, 231-248 (1997).
- Chen, Y. -. L., Chang, S., Chen, T. -. T., Lee, C. -. K. Efficient Generation of Plasmacytoid Dendritic Cell from Common Lymphoid Progenitors by Flt3 Ligand. PLoS ONE. 10 (8), e0135217 (2015).
