We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain’s vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.
मस्तिष्क में, नाड़ी तंत्र में से अधिकांश एक चयनात्मक बाधा के होते हैं, मस्तिष्क और रक्त के बीच अणुओं और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के आदान-प्रदान को नियंत्रित करता है कि रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB)। इसके अलावा, विशाल न्यूरोनल चयापचय की मांग रक्त के प्रवाह का एक पल-टू-पल विनियमन की आवश्यकता है। उल्लेखनीय है कि इन नियमों की असामान्यताएं सबसे मस्तिष्क विकृतियों के etiological पहचान कर रहे हैं; , ब्रेन ट्यूमर, साथ ही इस तरह के मल्टिपल स्क्लेरोसिस, दिमागी बुखार और पूति प्रेरित मस्तिष्क रोग के रूप में भड़काऊ शर्तों: ग्लियोब्लास्टोमा, स्ट्रोक, सूजन, मिर्गी, अपक्षयी रोगों (पार्किंसंस रोग, अल्जाइमर रोग पूर्व) भी शामिल है। इस प्रकार, cerebrovascular शरीर क्रिया विज्ञान नियमन संकेत घटनाओं को समझने के लिए एक बड़ी चुनौती है। Cerebrovascular सिस्टम रचना कि विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के सेलुलर और आणविक गुणों में बहुत अंतर्दृष्टि हौसले से अलग मस्तिष्क के ऊतकों से छँटाई प्राथमिक संस्कृति या सेल से प्राप्त किया जा सकता है। तथापि,इस तरह के सेल polarity, आकृति विज्ञान और कहनेवाला संबंधों के रूप में गुण इस तरह की तैयारी में नहीं रखा जाता। हम यहाँ वर्णन है कि प्रोटोकॉल संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखने, मस्तिष्क पोत टुकड़े को शुद्ध करने के लिए बनाया गया है। हम अलग-थलग वाहिकाओं एक सतत आधारी पटल से घिरे रहे हैं कि तंग जंक्शनों द्वारा सील endothelial कोशिकाओं से मिलकर बनता है कि दिखा। Pericytes, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के साथ ही परिवाहकीय अस्थिकणिका endfeet झिल्ली endothelial परत में जुड़े रहते हैं। अंत में, हम शुद्ध मस्तिष्क जहाजों पर immunostaining के प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए कैसे का वर्णन है।
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के समुचित कार्य के एक उच्च विनियमित बाह्य वातावरण की आवश्यकता होती है, और इसके चयापचय की मांग अन्य अंगों 1 की तुलना में भारी रहे हैं। सीएनएस भी आम तौर पर परिधीय अंगों को नुकसान न पहुंचाने लेकिन यह करने के लिए, न्यूरोटौक्सिक रसायनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए बेहद संवेदनशील है। सही कार्य सुनिश्चित करने के लिए, सीएनएस 'वाहिका के सबसे एक endothelial बाधा रूपों; अणुओं और आयनों के प्रवाह के साथ ही खून और दिमाग के बीच प्रतिरक्षा कोशिकाओं के पारित होने को नियंत्रित करता है जो रक्त मस्तिष्क बाधा (बीबीबी), इस प्रकार में बाधा उपचार जिससे उचित समस्थिति 2 को बनाए रखने, लेकिन यह भी चिकित्सीय औषधियों के प्रवेश को सीमित के मस्तिष्क संबंधी बीमारियों 3। सेलुलर स्तर पर, बीबीबी मुख्य रूप से endothelial कोशिकाओं, तपका ट्रांसपोर्टरों की ध्रुवीकृत अभिव्यक्ति और एक बहुत कम transcytosis दर 4 के बीच व्यापक तंग जंक्शनों द्वारा निरंतर है। गुण और BBB के कार्यों ज्यादातर NE द्वारा प्रेरित कर रहे हैंighboring कोशिकाओं 4। विशेष रूप से, pericytes बीबीबी 5,6 उत्प्रेरण और बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। बड़े जहाजों के आसपास के चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के रूप में करते सिकुड़ा कोशिकाओं होने के नाते, pericytes भी रक्त प्रवाह 7 विनियमित। अंत में, astrocytes, मस्तिष्क के प्रमुख glial कोशिकाओं, endfeet के आसपास नामित बड़े प्रक्रियाओं भेजने के मस्तिष्क वाहिका 8 की सबसे अधिक है और बीबीबी अखंडता और प्रतिरक्षा निष्क्रियता 9, 10 न्यूरॉन्स को चयापचयों का हस्तांतरण मिलाना, और neuronal गतिविधि के बीच तंग युग्मन प्रेरित और रक्त का प्रवाह 11,12।
cerebrovascular सिस्टम के आणविक और सेलुलर गुणों का अध्ययन करने की क्षमता मस्तिष्क शरीर विज्ञान और physiopathology के लिए अपने योगदान बेहतर चिह्नित करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस सवाल से निपटने के लिए, मस्तिष्क के cerebrovascular सिस्टम को अलग-थलग करने के लिए रणनीति बरकरार मस्तिष्क पोत टुकड़े की तैयारी के लिए अनुमति देते हैं, जो विकसित किया गया है। सेरेब्रल पोत पीurification शुरू में विशेष कृन्तकों 14 में, अन्य प्रजातियों के लिए गोजातीय दिमाग 13 का उपयोग वर्णित और सुधार हुआ है और अनुकूलित किया गया था। यह पिछले अध्ययन में, अलग-अलग आकार के फिल्टर के उपयोग के विभिन्न व्यास की वाहिकाओं में समृद्ध भिन्न करने में मस्तिष्क वाहिकाओं को अलग करने के लिए पेश किया गया था। दिलचस्प है, इस तरह की तैयारी में, endothelial कोशिकाओं उनके चयापचय गुण 15, ट्रांसपोर्टर कार्यक्षमता 16 और ध्रुवीकरण 17 रखा। यहाँ, हम विस्तार में इस प्रोटोकॉल का वर्णन है और आगे पृथक वाहिकाओं सीटू संरचनाओं में अपने के अधिकांश बरकरार है कि प्रदर्शित करता है। Endothelial कोशिकाओं तंग जंक्शनों से जुड़ा हुआ है और एक सतत आधारी पटल से घिरे रहते हैं। Pericytes और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं endothelial परत, साथ ही परिवाहकीय अस्थिकणिका झिल्ली में जुड़े रहते हैं। हालांकि, astrocytes, microglial कोशिकाओं, न्यूरॉन्स और oligodendrocytes समाप्त हो जाते हैं। अन्त में, हम पृथक मस्तिष्क जहाजों पर immunostaining प्रदर्शन करने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन। </p>
अब तक मस्तिष्क प्रणाली के विषय में आणविक और सेलुलर अध्ययन के सबसे द्वारा अलग शुद्ध मस्तिष्क पोत कोशिकाओं पर प्रदर्शन किया गया है सेल सेल छँटाई विशेष संवाददाता माउस उपभेदों या immunostaining आधारित प्रक्रियाओं 18,19 इस्तेमाल करते हैं। इन तकनीकों के लगभग शुद्ध cerebrovascular सेल आबादी के अलगाव के लिए अनुमति देता है, अलग कक्षों पूरी तरह से बदले में, बहुत अपने आणविक और सेलुलर गुणों को प्रभावित करता है जो उनके बगल में आकृति विज्ञान और बातचीत, खो देते हैं। प्रोटोकॉल, विशिष्ट एंटीबॉडी या ट्रांसजेनिक माउस दाग की कोई जरूरत के साथ पूरे cerebrovascular टुकड़े के अलगाव के लिए अनुमति देता है, यहाँ वर्णित उनके आणविक संपत्तियों पर नतीजों को कम करने, इस प्रकार, संरक्षित है पृथक मस्तिष्क वाहिकाओं के समग्र संरचना के रूप में एक अच्छा विकल्प प्रदान करता है। हाल ही में 20,21 वर्णित के रूप में पृथक वाहिकाओं तो बीबीबी पर जीन गतिविधि, प्रोटीन संश्लेषण और विनियमन के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है </sup>। अंत में, लेजर कब्जा microdissection 22,23 की तुलना में वर्तमान प्रोटोकॉल, सस्ती प्रदर्शन करने के लिए आसान है और किसी भी प्रयोगशाला में तेजी से अनुकूल है।
रक्त मस्तिष्क बाधा सीएनएस के अंदर और बाहर शारीरिक पदार्थों के पारित होने को नियंत्रित करता है और रक्त में मौजूद हानिकारक पदार्थ के खिलाफ यह सुरक्षा करता है। यह neurodegenerative रोगों 2 और मस्तिष्क ट्यूमर 28…
The authors have nothing to disclose.
इस काम Labex MemoLife द्वारा और ARSEP द्वारा समर्थित किया गया (फ़ोंडेशं ला Recherche सुर ला sclérose एन सजीले टुकड़े à ल सहयोगी डालना)
Tissue Grinder Size C | Thomas scientific | 3431E25 | |
centrifuge 5415 R | Eppendorf | ||
centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5811000320 | |
High-performance, Modular Stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
Compact System Provides High Quality Leica LED1000 | Leica | LED1000 | |
low binding tips (P1000) | Sorenson BioScience | 14200T | |
Swinnex 47mm filter holder PP 8/Pk | Millipore | SX0004700 | |
Nylon net filter disc Hydrophilic 20µm 47mm 100/Pk | Millipore | NY2004700 | |
Nylon net filter disc Hydrophilic 100µm 47mm 100/Pk | Millipore | NY1H04700 | |
Standard Wall Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | B150-86-7.5 | |
Microscope Slides | Thermo Scientific | 1014356290F | |
Cover Slips, Thickness 1 | Thermo Scientific | P10143263NR1 | |
0,2 ml Thin-walled tubes and domed cap | Thermo Scientific | AB-0266 | |
PARAFILM® M (roll size 4 in. × 125 ft) | Sigma | P7793-1EA | |
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Life technology | 14175-129 | |
HEPES (1M) | Life technology | 15630056 | |
Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000 | Sigma | 31390 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
PBS 10X | Euromedex | ET330 | |
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Scientific | 28908 | |
Triton™ X-100 | Sigma | X100 | |
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma | 14533 | |
Mounting medium Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor® 488 Conjugate; Dilution 1/100 | Life technology | I21411 | |
Agrin (rabbit) ; dilution 1/400 | kindly provided by Dr Markus A Ruegg | ||
Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12) | Life technology | 33-9100 | dilution 1:500 |
Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4) | Sigma | A2547 | dilution 1:500 |
Anti GFAP (mouse, clone GA5) | Sigma | G3893 | dilution 1:500 |
Anti AQP4 (rabbit) | Sigma | A5971 | dilution 1:500 |
Anti Cx43 (mouse, Clone 2) | BD Biosciences | 610061 | dilution 1:500 |
Anti Olig2 (rabbit) | Millipore | AB9610 | dilution 1:200 |
Anti NF-M (mouse) | provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland. | dilution 1:10 | |
Anti Iba1 (rabbit) | Wako | 019-19741 | dilution 1:400 |
Alexa Fluor® 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technology | A11029 | dilution 1:2000 |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 488 conjugate | Life technology | A11034 | dilution 1:2000 |
Alexa Fluor® 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technology | A21424 | dilution 1:2000 |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 555 conjugate | Life technology | A21429 | dilution 1:2000 |