Activité caspase-3 dans l'amygdale Rat mesurée par spectrofluorimétrie après infarctus du myocarde

Les animaux sont traités en conformité avec la réglementation du Comité de protection des animaux locale, en conformité avec les lignes directrices du Conseil canadien de protection des animaux. Les rats sont logés individuellement dans des conditions constantes (température de 21-22 ° C et une humidité de 40-50%), y compris un cycle de lumière-obscurité de 12 heures, à partir de 08h00. Pastilles Chow et l'eau du robinet sont disponibles ad libitum pendant toute l'étude. Une période d'acclimatation de 3 jours après la livraison par le fournisseur est autorisé avant l'expérience. Des rats Sprague-Dawley pesant entre 300-800 g ont été systématiquement utilisés avec ce protocole. 1. Chirurgie MI Induire une anesthésie avec des injections intra-péritonéales de kétamine 60 mg / kg et de xylazine 10 mg / kg. Confirmez anesthésie appropriée par l'absence de réflexe lorsque les pattes sont pincés. Rasez site chirurgical. Intuber rat avec un tube d'intubation: le cathéter (16G 1,77 pouces) et placez animal en position de décubitus latéral. Placez les animaux sur un coussin chauffant pour maintenir la température autour de 37 ° C. Connectez le tube d'intubation à l'isoflurane 2%. Préparer site chirurgical avec le gluconate de chlorhexidine et de l'alcool isopropylique. Pendant l'opération, utiliser des gants stériles et des instruments stérilisés. Appliquer une pommade ophtalmique à deux yeux pour prévenir la sécheresse tandis que sous anesthésie. Mettez champ stérile sur animaux et les instruments sur un autre champ stérile à côté de l'animal. Inciser la peau avec une lame de bistouri n ° 10. Décoller le tissu musculaire avec une pince hémostatique. Placez l'animal en décubitus ventral. Ouvrir paroi thoracique avec une pince et la position hémostatique poitrine écarteur. Ouvrir le péricarde avec une pince hémostatique. Pour produire une occlusion coronarienne, une boucle 360 ​​mm de long autour de suture en soie 4-0 de l'artère coronaire descendante, en passant par le tissu myocardique contiguë. Insérer les deux extrémités de la suture de soie dans un 14G, long tube de plastique de 1,25 cm. Tirer les deux extrémités du fil de suture en soie et push le tube vers le bas contre l'artère pour boucher ce, pendant 40 min. Occlusion sécurisé par serrage du tube en plastique avec une pince hémostatique. Après 40 min, libérer l'occlusion en libérant la pince hémostatique, puis en enlevant le tuyau et la soie suture flexible. Remarque: Les rats témoins Sham subissent le même mode opératoire chirurgical moins l'occlusion de l'artère coronaire. Avant la fermeture de la paroi thoracique, placer un cathéter souple (18G, 4,5 cm) à travers la cavité thoracique pour aspirer l'air sur le thorax avec une seringue de 5 ml pour empêcher un pneumothorax. Fermer cavité thoracique avec 2-0 suture, point le muscle avec 4-0 suture de soie et de la peau avec une suture de soie 3-0. Avant de fermer le dernier point de la peau, tirer à nouveau l'air du thorax avec 5 ml seringue à travers le cathéter placé précédemment dans la cavité thoracique. Suturer dernier point de la peau. Arrêtez la ventilation isoflurane. Surveiller l'éveil de rat. Ne pas laisser un animal sans surveillance jusqu'à ce qu'il ait regained conscience suffisante pour maintenir décubitus sternal. Traiter chaque rat 8 h pendant 24 heures avec un analgésique (buprénorphine, 0,05 mg / kg ip) et avec un antibiotique (une dose unique de duplocillin, 0,2 mg / kg ip). Après la chirurgie, les rats de maison individuelle jusqu'au moment du sacrifice, soit 3 jours post-IM. Taille de l'infarctus, essentiellement la nécrose, est exprimé comme la proportion de tissu infarci dans la zone à risque du ventricule gauche. Cela peut coloration mesurée en utilisant 11 triphényltétrazolium. 2. Isolement amygdale Placer la première tête d'animal dans un sac en forme de cône, avec son nez faisant saillie hors de l'ouverture d'extrémité étroite. Rat sécurisé pour éviter tout mouvement. Placez la tête de manière appropriée sur la guillotine, entre les lames de ciseaux. Décapitez animal. Lieu la tête du rat dans un plat maintenu sur de la glace pilée. Effectuez toutes les procédures pour l'isolement de tissu sur de la glace pilée (4 ° C). Sk ouverte CouperULL avec des ciseaux, détacher soigneusement gaines osseuses avec rongeurs d'os en tirant et en évitant mutiler le tissu en dessous. Placer la lame plate d'une spatule entre le fond de la boîte crânienne et la surface ventrale postérieure du cerveau et soigneusement détacher cerveau de crâne par doucement pousser la lame vers l'avant le long du fond de la boîte crânienne jusqu'à ce que le cerveau peut être lentement soulevé vers le haut hors de la crâne. Jeter le crâne. Placer cerveau sur sa face dorsale. Identifier hypothalamus (structure avant du cervelet) et couper le cerveau coronaire devant son extrémité antérieure et derrière son extrémité postérieure; jetez les parties antérieure et postérieure du cerveau si non nécessaire pour d'autres usages. Visualisez les amygdalas que de petites sphères sous les lobes temporaux, bilatéralement, juste à côté de l'hypothalamus. Retournez le plat du cerveau sur son extrémité frontale, surface dorsale loin de l'expérimentateur. Commencez par le côté gauche ou droit du cerveau. Séparer l'hémisphères et puis le cortex de l'amygdale contigus. Couper façon d'environ 8 mm de ce cortex lâche pour permettre l'isolement de l'amygdale. Coupez amygdale avec scalpel. Isoler la partie basolatéral de l'amygdale de sa partie centromedial en coupant le long de la suture sombre qui se retrouve à travers elle, presque moitié-moitié. Cette structure ne sont pas toujours facilement identifiable. Mettez sous-parties de l'amygdale dans des fioles distinctes identifiées et de garder sur la glace pilée. Procédure de dissection Répétez avec l'autre hémisphère. Immerger les flacons dans l'azote liquide pendant 1 minute. Conserver le flacon dans -80 ° C congélateur jusqu'à nécessaire. 3. activité caspase-3 Préparer du tampon de lyse avec 0,32 M de saccharose, 1% de Triton-X-100, 10 mM de Tris-HCl, pH 8, 5 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique, 2 mM de dithiothréitol, 1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle, 10 ug / ul de leupeptine , 10 ug / ul de la pepstatine A et de 10 pg / pl d'aprotinine. Ajouter 150 ul de tampon de lyse à chaque échantillon (5-10 mg). Garder sur la glace. Soniquer chaque échantillon sur la glace pendant 5 secondes à intensité maximale (40 W). Incuber les tissus dans du tampon de lyse sur de la glace pendant 30 min. Vortexer chaque échantillon pendant 5 min. Effectuez 3 cycles de gel / dégel en plaçant des échantillons alternativement dans l'azote liquide et sur une plaque de chauffage thermostaté réglé à 37 ° C. Tissu Centrifugeuse à 13000 g (4 ° C) pendant 10 min. Retirez délicatement le surnageant et de garder dans le tube sur la glace. Préparer des concentrations de protéine standards entre 0 et 10 ug / ml avec de l'albumine de sérum bovin. Préparer blancs avec tampon seulement. Ajouter 200 pi de réactif de Bradford à chaque norme. Lire standard à 595 nm. Pour des niveaux de protéines, ajouter 5 pl d'échantillon surnageant à 795 ul d'eau distillée et 200 ul de réactif de Bradford. Lire chaque échantillon à 595 nm et de quantifier les protéines avec courbe standard. Préparer du tampon de réaction avec 50 mM de Tris-HCl, pH 7, 5 mM de MgCl 2 </ sub>, 1 mM d'éthylène glycol de l'acide tétra-acétique, 0,1% de 3-cholamidopropyl) diméthylammonio] -1-propanesulfonate et 1 mM de dithiothréitol. Ajouter 25 pg de protéine de tampon de réaction et la caspase-3 pour obtenir des échantillons de substrats réactifs positifs et négatifs. Pour les échantillons négatifs, ajouter un tampon de réaction, 25 pg de protéines, 0,4 pi de Ac-DEVD-CHO 800 uM et 0,8 pi d'Ac-DEVD-AMC 10 mM. Pour les échantillons positifs, ajouter 25 pg de protéine de tampon de réaction et 0,8 ul d'Ac-DEVD-AMC 10 mM. Traiter tous les échantillons négatifs et positifs en trois exemplaires. Compléter le volume final de chaque échantillon jusqu'à 200 pi en ajoutant un tampon de réaction. Produire des témoins négatifs en ajoutant 188,7 pi de tampon de réaction de 0,5 pi de Ac-DEVD-CHO 800 uM, 0,8 ul Ac-DEVD-AMC 10 mM et 10 pi de tampon de lyse. Pour les témoins positifs, ajouter 189,2 pi de tampon de réaction, 0,8 pi d'Ac-DEVD-AMC 10 mM et 10 pi de tampon de lyse. Incuber les échantillons etcontrôles dans l'obscurité pendant 3 heures à 37 o C. Arrêter la réaction avec 600 ul de glycine 0,4 M et de NaOH 0,4 M (pH 10) à chaque échantillon et de contrôle. Quantifier la fluorescence par spectrofluorométrie au excitation longueur d'onde de 365 nm de longueur d'onde et l'émission de 465 nm. Ajouter 2 ml d'eau distillée à une réaction dans la cuve de verre. Lire contrôles et les échantillons pendant 10 secondes avec 1 point à chaque sec. Quantifier l'activité spécifique dans chaque échantillon: ((fluorescence des échantillons négatifs moins de fluorescence d'échantillons positifs) x volume de 2,8 ml) divisé par (le temps d'incubation de 3 heures x quantité de protéine 25 mg).