Caspasa-3 La actividad en la amígdala de rata Medido por espectrofluorometría Después de Infarto de Miocardio

Los animales son manejados de acuerdo con la regulación del Comité de Cuidado de Animales local, de conformidad con las directrices del Consejo Canadiense de los Animales. Las ratas se alojan individualmente bajo condiciones constantes (temperatura de 21-22 ºC y una humedad del 40-50%), incluyendo un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas, comenzando a las 08:00 am. Pellets de Chow y agua corriente están disponibles ad libitum durante todo el estudio. Se permite un período de aclimatación de 3 días después de la entrega por el proveedor antes del experimento. Ratas macho Sprague-Dawley con un peso de 300-800 g entre han sido utilizados rutinariamente con este protocolo. 1. MI Cirugía Inducir la anestesia con inyecciones intraperitoneales de ketamina 60 mg / kg y xilazina 10 mg / kg. Confirme anestesia adecuada por la ausencia de reflejos cuando se pellizcan las zarpas. Afeitado sitio quirúrgico. Intubar rata con un tubo endotraqueal: catéter (16G 1,77 pulgadas) y colocar los animales en decúbito lateral. Coloque los animales en una almohadilla térmica para mantener la temperatura alrededor de 37 ° C. Conecte el tubo endotraqueal al isoflurano 2%. Preparar sitio quirúrgico con gluconato de clorhexidina y alcohol isopropílico. Durante la cirugía, use guantes estériles e instrumentos esterilizados. Aplicar pomada oftálmica de ambos ojos para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia. Ponga campo estéril en los animales y los instrumentos sobre otro campo estéril al lado del animal. Incisión de la piel con hoja de bisturí # 10. Despegar el tejido muscular con una pinza hemostática. Colocar el animal en decúbito ventral. Pared torácica abierta con una pinza y la posición de retracción torácica hemostático. Pericardio abierto con una pinza hemostática. Para producir la oclusión coronaria, un bucle de 360 ​​mm de largo sutura de seda de 4-0 alrededor de la arteria coronaria descendente, pasa a través del tejido miocárdico contigua. Inserte ambos extremos de la sutura de seda en una 14G, tubo de plástico largo 1,25 cm. Tire de ambos extremos de la sutura de seda y push el tubo hacia abajo contra la arteria para ocluir que, por 40 min. Oclusión Secure sujetando el tubo de plástico con una pinza hemostática. Después de 40 min, liberar la oclusión por la liberación de la pinza hemostática, seguido de la eliminación del tubo flexible de sutura y seda. Nota: el control de ratas Sham someten al mismo procedimiento quirúrgico menos la oclusión de la arteria coronaria. Antes de cerrar la pared torácica, colocar un catéter flexible (18G, 4,5 cm) a través de la cavidad torácica para extraer el aire fuera del tórax con una jeringa de 5 ml para prevenir el neumotórax. Cerrar cavidad torácica con 2-0 sutura, puntada del músculo con 4-0 sutura de seda y la piel con sutura de seda 3-0. Antes de cerrar el último punto de la piel, de nuevo extraer el aire fuera del tórax con 5 ml jeringa a través del catéter colocado previamente en la cavidad del tórax. Suturar último punto de la piel. Deje de ventilación isoflurano. Monitorear el despertar de la rata. No deje a un animal sin vigilancia hasta que tenga regained conciencia suficiente para mantener decúbito esternal. Tratar rata cada 8 h durante 24 h con un analgésico (buprenorfina, 0,05 mg / kg ip) y con un antibiótico (una dosis única de duplocillin, 0,2 mg / kg ip). Después de la cirugía, las ratas de la casa de forma individual hasta la hora del sacrificio, es decir, 3 días después de la MI. El tamaño del infarto, principalmente necrosis, se expresa como el porcentaje de tejido infartado en el área en riesgo del ventrículo izquierdo. Esto puede medido utilizando la coloración de trifeniltetrazolio 11. 2. amígdala Aislamiento Coloque la cabeza del animal por primera vez en una bolsa en forma de cono, con su nariz que sobresale de la abertura de extremo estrecho. Rata seguro para evitar cualquier movimiento. Coloque la cabeza apropiada en la guillotina, entre las hojas de las tijeras. Decapitar a los animales. Coloque la cabeza de la rata en un plato mantuvo en hielo picado. Realizar todos los procedimientos para el aislamiento de tejido en hielo picado (4 ° C). Sk abierta Cortarull con tijeras, separar cuidadosamente envolturas óseas con gubia ósea tirando hacia arriba y evitar la mutilación de los tejidos debajo. Coloque la punta plana de una espátula entre la parte inferior del cráneo y la superficie ventral posterior del cerebro y separar cuidadosamente cerebro de cráneo empujando suavemente la cuchilla hacia adelante a lo largo de la parte inferior del cráneo hasta que el cerebro puede ser levantado lentamente fuera de la cráneo. Deseche el cráneo. Coloque el cerebro en su superficie dorsal. Identificar hipotálamo (estructura en la parte delantera del cerebelo) y cortar el cerebro coronal delante de su extremo anterior y detrás de su extremo posterior; descartar las partes anterior y posterior del cerebro si no es necesario para otros usos. Visualice las amígdalas como pequeñas esferas debajo de los lóbulos temporales, de forma bilateral, justo al lado del hipotálamo. Da la vuelta al cerebro plana en su extremo frontal, superficie dorsal de distancia del experimentador. Comience con el lado izquierdo o derecho del cerebro. Separar el hemiesferas y luego la corteza de la amígdala contigua. Cortar manera alrededor de 8 mm de esta corteza floja para permitir el aislamiento de la amígdala. Cortar la amígdala con el bisturí. Aislar la parte basolateral de la amígdala de su parte centromedial cortando a lo largo de la sutura oscura que corre a través de ella, casi mitad y mitad. Esta estructura no siempre es fácil de identificar. Ponga subpartes amígdala en viales identificados por separado y mantener en hielo picado. Procedimiento de disección Repita con el otro hemisferio. Sumergir viales en nitrógeno líquido durante 1 min. Mantenga vial en -80 ° C congelador hasta que se necesite. 3. actividad caspasa-3 Preparar tampón de lisis con 0,32 M de sacarosa, 1% de Triton-X-100, 10 mM de Tris-HCl, pH 8, 5 mM de ácido etilendiaminotetraacético, 2 mM de ditiotreitol, 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 10 mg / l de leupeptina , 10 g / l de pepstatina A y 10 g / l de aprotinina. Añadir 150 ml de tampón de lisis a cada muestra (5-10 mg). Mantenga en hielo. Sonicar cada muestra en hielo durante 5 segundos a intensidad máxima (40 W). Incubar el tejido en tampón de lisis en hielo durante 30 min. Vortex cada muestra durante 5 min. Realizar ciclos de 3 de congelación / descongelación colocando alternativamente muestras en nitrógeno líquido y en una placa de calefacción controlada por termostato a 37 ° C. Centrifugar a 13000 tejido g (4 ° C) durante 10 min. Retire con cuidado el sobrenadante y mantener en el tubo en hielo. Preparar las concentraciones de proteína estándar entre 0 y 10 mg / ml con albúmina de suero bovino. Preparar espacios en blanco con solamente búfer. Añadir 200 l de reactivo de Bradford a cada norma. Leer estándar a 595 nm. Para los niveles de proteína, añadir 5 l de muestra de sobrenadante a 795 l de agua destilada y 200 l de reactivo de Bradford. Lea cada muestra a 595 nm y cuantificar la proteína con la curva estándar. Preparar tampón de reacción con 50 mM Tris-HCl, pH 7, 5 mM de MgCl de 2 </ sub>, 1 mM de ácido tetraacético etilenglicol, 0,1% de 3-colamidopropil) dimetilamonio] -1-propanosulfonato y 1 mM de ditiotreitol. Añadir 25 g de proteína a sustratos de tampón de reacción y la caspasa-3 para obtener muestras de reactivos positivos y negativos. Para las muestras negativas, añadir tampón de reacción, 25 g de proteína, 0,4 l de Ac-DEVD-CHO 800 mM y 0,8 l de Ac-DEVD-AMC 10 mM. Para las muestras positivas, añadir 25 g de proteína al tampón de reacción y 0,8 l de Ac-DEVD-AMC 10 mM. Procesar todas las muestras negativas y positivas por triplicado. Completar el volumen final de cada muestra hasta 200 l mediante la adición de tampón de reacción. Producir controles negativos mediante la adición de 188,7 l de tampón de reacción a 0,5 l de Ac-DEVD-CHO 800 M, 0,8 l Ac-DEVD-AMC 10 mM y 10 l de tampón de lisis. Para los controles positivos, añadir 189,2 l de tampón de reacción, 0,8 l de Ac-DEVD-AMC 10 mM y 10 l de tampón de lisis. Incubar las muestras ycontroles en la oscuridad durante 3 horas a 37 ° C Detener la reacción con 600 l de glicina 0,4 M y NaOH 0,4 M (pH 10) en cada muestra y control. Cuantificar la fluorescencia por espectrofluorometría en la excitación de longitud de onda de 365 nm de longitud de onda y la emisión de 465 nm. Añadir 2 ml de agua destilada a la reacción en cubeta de vidrio. Leer los controles y las muestras durante 10 segundos con 1 punto en cada seg. Cuantificar la actividad específica en cada muestra: ((La fluorescencia de las muestras negativas, menos la fluorescencia de las muestras positivas) x volumen de 2,8 ml) dividido por (tiempo de incubación de 3 horas x cantidad de proteína de 25 mg).