SH-SY5Y İnsan Nöroblastom Hücre Hattı Farklılaşma
Summary
It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications.
Abstract
Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and the neurosciences. Traditional in vitro experimental models used in neurobiology include primary neuronal cultures from rats and mice, neuroblastoma cell lines including rat B35 and mouse Neuro-2A cells, rat PC12 cells, and short-term slice cultures. While many researchers rely on these models, they lack a human component and observed experimental effects could be exclusive to the respective species and may not occur identically in humans. Additionally, although these cells are neurons, they may have unstable karyotypes, making their use problematic for studies of gene expression and reproducible studies of cell signaling. It is therefore important to develop more consistent models of human neurological disease.
The following procedure describes an easy-to-follow, reproducible method to obtain homogenous and viable human neuronal cultures, by differentiating the chromosomally stable human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y. This method integrates several previously described methods1-4 and is based on sequential removal of serum from media. The timeline includes gradual serum-starvation, with introduction of extracellular matrix proteins and neurotrophic factors. This allows neurons to differentiate, while epithelial cells are selected against, resulting in a homogeneous neuronal culture. Representative results demonstrate the successful differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells from an initial epithelial-like cell phenotype into a more expansive and branched neuronal phenotype. This protocol offers a reliable way to generate homogeneous populations of neuronal cultures that can be used for subsequent biochemical and molecular analyses, which provides researchers with a more accurate translational model of human infection and disease.
Introduction
Vitro model sistemlerinde kullanma yeteneği büyük ölçüde nörobiyoloji ve nörolojik bilimler alanlarını artırmıştır. kültürde Hücreler hastalık ve enfeksiyon patolojisi anlamak ve ön uyuşturucu testi değerlendirmeleri gerçekleştirmek için, protein işlevsellik ve moleküler mekanizmalar yatan spesifik olayları karakterize etmek verimli bir platform sağlar. Nörobiyolojisinde, hücre kültürü modelleri arasında en önemli tipleri, örneğin, sıçan B35 hücreleri 5, Neuro-2A, fare hücreleri 6 ve sıçan PC12 hücrelerinin 7 gibi sıçan ve fareler ve nöroblastom hücre çizgilerinden türetilen primer nöron kültürleri içerir. Bu hücre çizgilerinin kullanımı önemli ölçüde alanı gelişmiş olmasına rağmen, insan olmayan hücreler ve doku tutulması ile ilgili çok sayıda karıştırıcı faktörler vardır. insanlara kıyasla bu anlayış türe özgü metabolik süreçlerde farklılıkları, hastalık tezahürü ve patogenezi fenotipleri içerir. Dikkat etmek de önemlidirkemirgen modellerinin sınırlamaları ve yollar kemirgenler ve insanlarda 8-11 arasında korunmuştur anlayış önemini vurgulayarak fare ve insan gen ifadesi ve transkripsiyon faktörü sinyalizasyon arasında önemli farklılıklar, yeniden bulunmaktadır. Diğer N-tera-2 (NT2), insan teratokarsinoma hücre hattı ve uyarılabilir pluripotent kök hücreler (iPSCs) dahil olmak üzere insan nöronal hücre çizgilerinin kullanımı kullanmışlardır. Bu hücre hatları in vitro insan sistemler için iyi modeller sunar. Bununla birlikte, retinoik asit (RA) nöronları, astrositler oluşan karışık bir popülasyonda oluşmasına neden ve ek saflaştırma adımı gerektiren radyal glial hücreleri 12 ile NT2 hücre farklılaşması nöronların saf popülasyonları elde edildi. Buna ek olarak, NT2 hücre hücrelerin% 72 daha büyük 60 kromozomlu bir çok değişken karyotipe 13 göstermektedir. iPSCs farklı hücre hatları arasında farklılaşmasında değişkenlik göstermektedir ve farklılaşma etkinliğinde değişiklik gösterebilir 14. Alternatiflerin güzelleştirmek için tutarlı ve tekrarlanabilir bir insan nöron hücresi modeli olması arzu edilen bir durumdur.
SH-SY5Y neuroblast benzeri hücreler, ebeveyn nöroblastoma hücre çizgisi SK-N-SH bir alt klon vardır. Parenteral hücre hatları neuroblast benzeri ve epitel benzeri hücreler 15 hem de içeren bir kemik iliği biyopsisinden 1970 üretilmiştir. SH-SY5Y hücreleri 47 kromozom içeren stabil karyotipe sahiptir ve farklı RA kullanımı dahil olmak üzere, mekanizma, forbol esterler ve beyin-türevi gibi belirli nörotrofinlerin çeşitli aracılığıyla, olgun insanlara özgü nöronlar bir neuroblast benzeri durumundan ayırt edilebilir nörotrofik faktör (BDNF). Önceki kanıtlar, farklı yöntemlerin kullanılması gibi adrenerjik, kolinerjik ve dopaminerjik nöronlar 16,17 gibi belirli nöron alt tipleri için seçebileceğiniz düşündürmektedir. Bu ikinci yönü Nörobiyoloji deneyler bir çok yararlı SH-SY5Y hücreleri sağlar.
ontent "> Çeşitli çalışmalar onların farklılaşmamış ve farklılaştırılmış devletlerde SH-SY5Y hücreleri arasındaki önemli farklılıklar kaydetti. Zaman SH-SY5Y hücreleri farklılaşmamış, onlar hızla çoğalır ve çok az, kısa süreçleri, polarize olmayan gözükmektedir. Bunlar genellikle büyümek farklılaştırılmış olgunlaşmamış nöronların 18,19 göstergesidir kümeleri ve ekspres belirteçleri., bu hücrelerin uzun kollara ayrılmış işlemleri, çoğalma azalma uzanır, ve bazı durumlarda 2,18 polarize. farklılaşmış SH-SY5Y hücreleri, daha önce bir ifade gösterilmiştir büyüme-ilişkili protein (GAP-43), nöronal çekirdekleri (Neun), sinaptofizin (SYN), sinaptik vezikül proteini II (SV2), nöron spesifik enolaz (NSE) ve mikrotübül ilişkili protein (MAP) dahil olgun nöronlar farklı belirteçlerin çeşitli 2,16,17,20, ve glial fibriller asidik protein (GFAP) 4 olarak glial markerlerin ifadesi için geçerli değildir. SH-SY5Y hücreleri huk ayırt fazla desteklemeknt homojen bir nöronal nüfus, BDNF kaldırılması hücresel apoptoz 4 sonuçlanır. Bu farklılaşmış SH-SY5Y hücrelerinin hayatta kalma nöronlar olgun benzer trofik faktöre bağlı olduğunu göstermektedir.Subclone 1978 3 yılında kurulmuştur beri SH-SY5Y hücrelerinin kullanımı artmıştır. Kullanımlarına bazı örnekler Parkinson hastalığı 17, Alzheimer hastalığı 21 ve poliovirüsün 22 enterovirüs 71 (EV71) gibi viral enfeksiyon patogenezi 23,24 soruşturma dahil , varicella-zoster virüsü (VZV), 1, insan sitomegalovirüs 25, ve herpes simpleks virüsü (HSV) 2,26. Özellikle neurovirology 27-36 alanında, SH-SY5Y hücreleri farklılaşmamış formunda bu hücreleri kullandık kullanarak bu çeşitli çalışmalar dikkat etmek önemlidir. ayırt SH-SY5Y hücrelerinin karşılık farklılaşmamış gözlenen fenotipin fark whe sorusunu gündeme getirmektedirTher enfeksiyon gözlenen ilerleme olgun farklılaştırılmış nöronlar farklı olurdu. Örneğin, farklılaşmış SH-SY5Y hücreleri, HSV bağlanan ve farklılaşmamış SH-SY5Y hücrelerinin 2 giriş modüle yüzeyi reseptörlerinin olmaması olabilir farklılaşmamış, prolifere olan SH-SY5Y hücrelerinin karşı, HSV-1 alımı, daha yüksek bir verimliliğe sahiptir. In vitro nöronları test odaklı bir deney tasarımı, SH-SY5Y hücreleri in vivo modeller için çeviri ve karşılaştırma için en doğru sonuçlar elde etmek için farklılaştırılması gerektiğini bu nedenle önemlidir.
insan nöronal kültürlerin üretmek için güvenilir bir yöntem geliştirme araştırmacılar doğru insan sinir sistemini modellemek öteleme deneyler gerçekleştirmek için izin zorunludur. Burada sunulan protokol farklılaşmış insan nöronlar için zenginleştirmek için önceki yöntemlerden 1-4 türetilen en iyi uygulamaları delineates bir işlemdirretinoik asit.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yukarıdaki protokol homojen ve uygun bir insan nöronal kültürler meydana getirmek için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Bu protokol teknikleri ve her birinin en iyi uygulamaları tanımlamak için birkaç daha önce yayınlanmış yöntemler 1-4 ve amaçlarını entegre uygulamaları kullanır. SH-SY5Y hücrelerinin farklılaşması kademeli serum yoksunluğu dayanır; retinoik asit, nörotrofik faktörler ve hücre dışı matris proteinlerinin eklenmesi; ve seri yarma farklılaşmış olgu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful for the contributions of Yolanda Tafuri in optimizing conditions for SH-SY5Y differentiation, and for the support of Dr. Lynn Enquist, in whose lab this work was initiated. Y. Tafuri contributed the images shown in Figure 3. This work was supported by the NIH-NIAID Virus Pathogens Resource (ViPR) Bioinformatics Resource Center (MLS and L. Enquist) and K22 AI095384 (MLS).
Materials
| B-27 | Invitrogen | 17504-044 | See Table 1 for preparation |
| Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) | Sigma | SRP3014 (10ug)/B3795 (5ug) | See Table 1 for preparation |
| dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP) | Sigma | D0627 | See Table 1 for preparation |
| DMSO | ATCC | 4-X | – |
| Minimum Essential Medium Eagle (EMEM) | Sigma | M5650 | – |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | See Table 1 for preparation |
| GlutamaxI | Life Technologies | 35050-061 | – |
| Glutamine | Hyclone | SH30034.01 | – |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-1 | See Table 1 for preparation |
| MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution | Sigma | E0282 | See step 11 of the protocol |
| Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | – |
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Life Technologies | 15140-122 | – |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | Should be stored in the dark at 4° C because this reagent is light sensitive |
| SH-SY5Y Cells | ATCC | CRL-2266 | – |
| 0.5% Trypsin + EDTA | Life Technologies | 15400-054 | – |
| Falcon 35mm TC dishes | Falcon (A Corning Brand) | 353001 | – |
Referências
- Christensen, J., Steain, M., Slobedman, B., Abendroth, A. Differentiated Neuroblastoma Cells Provide a Highly Efficient Model for Studies of Productive Varicella-Zoster Virus Infection of Neuronal Cells. Journal of Virology. 85 (16), 8436-8442 (2011).
- Gimenez-Cassina, A., Lim, F., Diaz-Nido, J. Differentiation of a human neuroblastoma into neuron-like cells increases their susceptibility to transduction by herpesviral vectors. Journal of Neuroscience Research. 84 (4), 755-767 (2006).
- Biedler, J. L., Roffler-Tarlov, S., Schachner, M., Freedman, L. S. Multiple Neurotransmitter Synthesis by Human Neuroblastoma Cell Lines and Clones. Pesquisa do Câncer. 38 (11 Pt 1), 3751-3757 (1978).
- Encinas, M., Iglesias, M., et al. Sequential Treatment of SH-SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain-Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor-Dependent, Human Neuron-Like Cells. Journal of Neurochemistry. 75 (3), 991-1003 (2000).
- Otey, C. A., Boukhelifa, M., Maness, P. B35 neuroblastoma cells: an easily transfected, cultured cell model of central nervous system neurons. Methods in Cell Biology. 71, 287-304 (2003).
- LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
- Shafer, T. J., Atchison, W. D. Transmitter, ion channel and receptor properties of pheochromocytoma (PC12) cells: a model for neurotoxicological studies. Neurotoxicology. 12 (3), 473-492 (1991).
- Yue, F., Cheng, Y., et al. A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome. Nature. 515 (7527), 355-364 (2014).
- Cheng, Y., Ma, Z., et al. Principles of regulatory information conservation between mouse and conservation between mouse and human. Nature. 515 (7527), 371-375 (2014).
- Stergachis, A. B., Neph, S., et al. Conservation of trans-acting circuitry during mammalian regulatory evolution. Nature. 515 (7527), 365-370 (2014).
- Lin, S., Lin, Y., et al. Comparison of the transcriptional landscapes between human and mouse tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17224-17229 (2014).
- Coyle, D. E., Li, J., Baccei, M. Regional Differentiation of Retinoic Acid-Induced Human Pluripotent Embryonic Carcinoma Stem Cell Neurons. PLoS ONE. 6 (1), e16174 (2011).
- Mostert, M. M., van de Pol, M., et al. Fluorescence in situ hybridization-based approaches for detection of 12p overrepresentation, in particular i(12p), in cell lines of human testicular germ cell tumors of adults. Cancer Genetics and Cytogenetics. 87 (2), 95-102 (1996).
- Hu, B. -. Y., Weick, J. P., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4335-4340 (2010).
- Biedler, J. L., Helson, L., Spengler, B. A. Morphology and growth, tumorigenicity, and cytogenetics of human neuroblastoma cells in continuous culture. Pesquisa do Câncer. 33 (11), 2643-2652 (1973).
- Påhlman, S., Ruusala, A. I., Abrahamsson, L., Mattsson, M. E., Esscher, T. Retinoic acid-induced differentiation of cultured human neuroblastoma cells: a comparison with phorbolester-induced differentiation. Cell Differentiation. 14 (2), 135-144 (1984).
- Xie, H., Hu, L., Li, G. SH-SY5Y human neuroblastoma cell line: in vitro cell model of dopaminergic neurons in Parkinson’s disease. Chinese Medical Journal. 123 (8), 1086-1092 (2010).
- Kovalevich, J., Langford, D. Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in neurobiology. Methods in Molecular Biology. 1078, 9-21 (2013).
- Påhlman, S., Hoehner, J. C., et al. Differentiation and survival influences of growth factors in human neuroblastoma. European Journal of Cancer. 31 (4), 453-458 (1995).
- Cheung, Y. -. T., Lau, W. K. -. W., et al. Effects of all-trans-retinoic acid on human SH-SY5Y neuroblastoma as in vitro model in neurotoxicity research. Neurotoxicology. 30 (1), 127-135 (2009).
- Agholme, L., Lindström, T., Kågedal, K., Marcusson, J., Hallbeck, M. An in vitro model for neuroscience: differentiation of SH-SY5Y cells into cells with morphological and biochemical characteristics of mature neurons. Journal of Alzheimer’s disease: JAD. 20 (4), 1069-1082 (2010).
- La Monica, N., Racaniello, V. R. Differences in replication of attenuated and neurovirulent polioviruses in human neuroblastoma cell line SH-SY5Y. Journal of Virology. 63 (5), 2357-2360 (1989).
- Cordey, S., Petty, T. J., et al. Identification of Site-Specific Adaptations Conferring Increased Neural Cell Tropism during Human Enterovirus 71 Infection. PLoS Pathog. 8 (7), e1002826 (2012).
- Xu, L. -. J., Jiang, T., et al. Global Transcriptomic Analysis of Human Neuroblastoma Cells in Response to Enterovirus Type 71 Infection. PLoS ONE. 8 (7), e65948 (2013).
- Luo, M. H., Fortunato, E. A. Long-term infection and shedding of human cytomegalovirus in T98G glioblastoma cells. Journal of Virology. 81 (19), 10424-10436 (2007).
- Sun, Z., Yang, H., Shi, Y., Wei, M., Xian, J., Hu, W. Establishment of a cell model system of herpes simplex virus type II latent infection and reactivation in SH-SY5Y cells. Wei Sheng Wu Xue Bao = Acta Microbiologica Sinica. 50 (1), 98-106 (2010).
- Yun, S. -. I., Song, B. -. H., et al. A molecularly cloned, live-attenuated japanese encephalitis vaccine SA14-14-2 virus: a conserved single amino acid in the ij Hairpin of the Viral E glycoprotein determines neurovirulence in mice. PLoS pathogens. 10 (7), e1004290 (2014).
- Garrity-Moses, M. E., Teng, Q., Liu, J., Tanase, D., Boulis, N. M. Neuroprotective adeno-associated virus Bcl-xL gene transfer in models of motor neuron disease. Muscle & Nerve. 32 (6), 734-744 (2005).
- Kalia, M., Khasa, R., Sharma, M., Nain, M., Vrati, S. Japanese Encephalitis Virus Infects Neuronal Cells through a Clathrin-Independent Endocytic Mechanism. Journal of Virology. 87 (1), 148-162 (2013).
- Haedicke, J., Brown, C., Naghavi, M. H. The brain-specific factor FEZ1 is a determinant of neuronal susceptibility to HIV-1 infection. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (33), 14040-14045 (2009).
- Xu, K., Liu, X. -. N., et al. Replication-defective HSV-1 effectively targets trigeminal ganglion and inhibits viral pathopoiesis by mediating interferon gamma expression in SH-SY5Y cells. Journal of molecular neuroscience: MN. 53 (1), 78-86 (2014).
- Oh, J., Fraser, N. W. Temporal association of the herpes simplex virus genome with histone proteins during a lytic infection. Journal of Virology. 82 (7), 3530-3537 (2008).
- Stiles, K. M., Milne, R. S. B., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J., Krummenacher, C. The herpes simplex virus receptor nectin-1 is down-regulated after trans-interaction with glycoprotein D. Virology. 373 (1), 98-111 (2008).
- Thomas, D. L., Lock, M., Zabolotny, J. M., Mohan, B. R., Fraser, N. W. The 2-kilobase intron of the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript has a half-life of approximately 24 hours in SY5Y and COS-1 cells. Journal of Virology. 76 (2), 532-540 (2002).
- Handler, C. G., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J. Cross-linking of glycoprotein oligomers during herpes simplex virus type 1 entry. Journal of Virology. 70 (9), 6076-6082 (1996).
- Nicola, A. V., Hou, J., Major, E. O., Straus, S. E. Herpes Simplex Virus Type 1 Enters Human Epidermal Keratinocytes, but Not Neurons, via a pH-Dependent Endocytic Pathway. Journal of Virology. 79 (12), 7609-7616 (2005).
- Korecka, J. A., van Kesteren, R. E., et al. Phenotypic characterization of retinoic acid differentiated SH-SY5Y cells by transcriptional profiling. PloS One. 8 (5), e63862 (2013).
- Presgraves, S. P., Ahmed, T., Borwege, S., Joyce, J. N. Terminally differentiated SH-SY5Y cells provide a model system for studying neuroprotective effects of dopamine agonists. Neurotoxicity Research. 5 (8), 579-598 (2004).
- Qiao, J., Paul, P., et al. PI3K/AKT and ERK regulate retinoic acid-induced neuroblastoma cellular differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 424 (3), 421-426 (2012).
