It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications.
Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and the neurosciences. Traditional in vitro experimental models used in neurobiology include primary neuronal cultures from rats and mice, neuroblastoma cell lines including rat B35 and mouse Neuro-2A cells, rat PC12 cells, and short-term slice cultures. While many researchers rely on these models, they lack a human component and observed experimental effects could be exclusive to the respective species and may not occur identically in humans. Additionally, although these cells are neurons, they may have unstable karyotypes, making their use problematic for studies of gene expression and reproducible studies of cell signaling. It is therefore important to develop more consistent models of human neurological disease.
The following procedure describes an easy-to-follow, reproducible method to obtain homogenous and viable human neuronal cultures, by differentiating the chromosomally stable human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y. This method integrates several previously described methods1-4 and is based on sequential removal of serum from media. The timeline includes gradual serum-starvation, with introduction of extracellular matrix proteins and neurotrophic factors. This allows neurons to differentiate, while epithelial cells are selected against, resulting in a homogeneous neuronal culture. Representative results demonstrate the successful differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells from an initial epithelial-like cell phenotype into a more expansive and branched neuronal phenotype. This protocol offers a reliable way to generate homogeneous populations of neuronal cultures that can be used for subsequent biochemical and molecular analyses, which provides researchers with a more accurate translational model of human infection and disease.
Muligheten til å bruke in vitro modellsystemer har kraftig forbedret innen nevrobiologi og nevrovitenskap. Celler i kultur gi en effektiv plattform for å karakterisere protein funksjon og molekylære mekanismer bak konkrete fenomener, for å forstå patologi av sykdom og smitte, og for å utføre foreløpige narkotika testing vurderinger. I nevrobiologi, de store typer cellekultur modeller inkluderer primære nevronale kulturer som stammer fra rotter og mus, og neuroblastom cellelinjer som rotte B35 celler 5, Neuro-2A museceller 6 og rotte PC12 celler 7. Selv om bruken av slike cellelinjer har avansert feltet betydelig, er det flere forstyrrende faktorer i forbindelse med håndtering av ikke-humane celler og vev. Disse inkluderer forståelse artsspesifikke forskjeller i stoffskiftet, fenotyper av sykdom manifestasjon, og patogenesen i forhold til mennesker. Det er også viktig å merke seg atre er betydelige forskjeller mellom mus og menneske genekspresjon og transkripsjonsfaktor signalering, fremhever begrensningene i gnagermodeller og viktigheten av å forstå hvilke veier er konservert mellom gnagere og mennesker 8-11. Andre har anvendt anvendelse av humane nervecellelinjer, inkludert N-Tera-2 (NT2) humant teratocarcinom cellelinje og induserbare pluripotente stamceller (iPSCs). Disse cellelinjene gi gode modeller for in vitro menneskelige systemer. Imidlertid differensiering av celler med NT2-retinsyre (RA) resulterer i genereringen av en blandet populasjon av neuroner, astrocytter, og radiale gliaceller 12, som nødvendiggjør et ytterligere rensetrinn for å oppnå rene populasjoner av neuroner. I tillegg NT2 celler demonstrere en svært variabel karyotype 13, med mer enn 60 kromosomer i 72% av cellene. iPSCs demonstrere variasjon i differensiering mellom ulike cellelinjer og varierer i differensiering effektivitet 14. Det er derfor ønskelig å ha en konsekvent og reproduserbar humane, neuronale cellemodell for å komplettere disse alternativene.
SH-SY5Y neuroblast lignende celler er en subklon av foreldre neuroblastom cellelinje SK-N-SH. Den foreldrecellelinjen ble generert i 1970 fra en benmargsbiopsi som inneholder både neuroblast-aktig og epitelceller-lignende celler 15. SH-SY5Y celler har en stabil karyotype bestående av 47 kromosomer, og kan skilles fra en neuroblast aktig tilstand til modne humane nerveceller ved en rekke forskjellige mekanismer, inkludert bruk av RA, forbolestere, og spesifikke neurotrofiner som hjerne-avledet neurotrophic factor (BDNF). Tidligere bevis tyder på at bruk av forskjellige metoder kan selektere for spesifikke neuron undertyper så som adrenerge, kolinerge, og dopaminerge neuroner 16,17. Dette siste aspektet gjør SH-SY5Y celler nyttige for en rekke neurobiology eksperimenter.
ontent "> Flere studier har notert viktige forskjeller mellom SH-SY5Y-celler i deres udifferensierte og differensierte tilstander. Når SH-SY5Y celler er udifferensierte de raskt spre seg og ser ut til å være ikke-polarisert, med svært få, korte prosesser. De ofte vokse i klumper og uttrykke markører som indikerer umodne nevroner 18,19. Når differensiert, disse cellene strekker lange, forgrenede prosesser, reduksjon i proliferasjon, og i noen tilfeller polarisere 2,18. fullt differensierte SH-SY5Y-celler har tidligere blitt vist å uttrykke en rekke ulike markører for modne nevroner inkludert vekst-assosiert protein (GAP-43), nevrale kjerner (Neun), synaptophysin (SYN), synaptisk vesikkelproteinet II (SV2), nervecellen enolase (NSE) og microtubule assosiert protein (MAP) 2,16,17,20, og å mangle uttrykk for glial markører som glial fibrillary surt protein (GFAP) 4. i ytterligere støtte som differensiert SH-SY5Y celler represent en homogen neuronal populasjon, fjerning av BDNF resulterer i cellulær apoptose 4. Dette tyder på at overlevelse av differensierte SH SY5Y-celler er avhengig av trofiske faktorer, i likhet med modne neuroner.Bruk av SH-SY5Y-celler har økt siden subklon ble etablert i 1978 3. Noen eksempler på deres anvendelse omfatter undersøke Parkinsons sykdom 17, Alzheimers sykdom 21, og patogenesen av viral infeksjon, inkludert poliovirus 22, enterovirus 71 (EV71) 23,24 , varicella-zoster virus (VZV) 1, human cytomegalovirus 25, og herpes simplex virus (HSV) 2,26. Det er viktig å merke seg at flere studier ved bruk av SH-SY5Y-celler har brukt disse cellene i deres udifferensierte form, spesielt når det gjelder neurovirology 27-36. Forskjellen i den observerte fenotype av udifferensiert versus differensierte SH-SY5Y celler reiser spørsmålet om whether den observerte utviklingen av infeksjon ville være annerledes i modne differensierte nevroner. For eksempel, differensierte SH-SY5Y celler har en høyere effektivitet av HSV-1 opptak versus udifferensierte, prolifererende SH-SY5Y celler, som kan være på grunn av mangel på overflatereseptorer som binder HSV og modulerer oppføring på udifferensierte SH-SY5Y celler 2. Det er derfor viktig at ved utformingen av et eksperiment rettet mot testing av nerveceller in vitro, burde SH-SY5Y-celler differensieres for å oppnå de mest nøyaktige resultater for oversettelse og sammenlignet med in vivo-modeller.
Utviklingen av en pålitelig metode for å generere menneskelige nevrale kulturer er viktig å gi forskerne utføre translasjonsforskning eksperimenter som nøyaktig modellere menneskelige nervesystemet. Protokollen som presenteres her er en prosedyre som avtegner beste praksis som stammer fra tidligere metoder 1-4 for å berike for menneske nevroner som skiller segved hjelp av retinsyre.
Ovennevnte protokollen gir en enkel og reproduserbar metode for å generere homogene og levedyktige menneskelige nevrale kulturer. Denne protokollen benytter teknikker og praksis som integrerer flere tidligere publiserte metoder 1-4 og tar sikte på å avgrense beste praksis i hver. Differensiering av SH-SY5Y celler er avhengig av gradvis serum deprivasjon; tilsetning av retinsyre, neurotrofiske faktorer og ekstracellulære matriseproteiner; og serie splitting å velge for differensierte modne tilhenger nevro…
The authors have nothing to disclose.
We are grateful for the contributions of Yolanda Tafuri in optimizing conditions for SH-SY5Y differentiation, and for the support of Dr. Lynn Enquist, in whose lab this work was initiated. Y. Tafuri contributed the images shown in Figure 3. This work was supported by the NIH-NIAID Virus Pathogens Resource (ViPR) Bioinformatics Resource Center (MLS and L. Enquist) and K22 AI095384 (MLS).
B-27 | Invitrogen | 17504-044 | See Table 1 for preparation |
Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) | Sigma | SRP3014 (10ug)/B3795 (5ug) | See Table 1 for preparation |
dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP) | Sigma | D0627 | See Table 1 for preparation |
DMSO | ATCC | 4-X | – |
Minimum Essential Medium Eagle (EMEM) | Sigma | M5650 | – |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | See Table 1 for preparation |
GlutamaxI | Life Technologies | 35050-061 | – |
Glutamine | Hyclone | SH30034.01 | – |
Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-1 | See Table 1 for preparation |
MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution | Sigma | E0282 | See step 11 of the protocol |
Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | – |
Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Life Technologies | 15140-122 | – |
Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | Should be stored in the dark at 4° C because this reagent is light sensitive |
SH-SY5Y Cells | ATCC | CRL-2266 | – |
0.5% Trypsin + EDTA | Life Technologies | 15400-054 | – |
Falcon 35mm TC dishes | Falcon (A Corning Brand) | 353001 | – |