JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Biologia do Desenvolvimento

Analyse af zebrafisk Larver Skeletmuskel Integritet med Evans blå farvestof

Published: November 30, 2015
doi:
10.3791/53183
, , ,
1Program in Genetics & Genome Biology,The Hospital for Sick Children, 2Department of Molecular Genetics,The University of Toronto, 3Program in Genomics of Differentiation,Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, 4Departments of Pediatrics and Neurology,University of Michigan

Summary

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Abstract

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

Introduction

Muscular dystrophies constitute a group of prevalent and heterogeneous human muscle diseases with specific histopathological features1,2. Symptoms typically associated with this devastating group of diseases include muscle weakness, muscle degeneration, loss of motility, and early mortality1,3. The primary pathomechanisms of muscular dystrophies are the loss of proteins that stabilize the sarcolemma, anchor transmembrane complexes, and mediate cell signaling across the membrane4-6. For example, complete loss of the protein dystrophin, a primary scaffold protein of the dystrophin-glycoprotein complex, results in destabilization of the muscle membrane in Duchenne muscular dystrophy7. Due to the fact that most muscular dystrophies result from mutations in proteins that participate in the link between the extracellular matrix and the sarcolemmal cytoskeleton, a common observation at the cellular level is the loss of sacrolemmal integrity8,9. This understanding of the primary pathomechanism(s) associated with muscular dystrophies is the product of numerous years of research employing animal model systems2,10-15. However, despite advances in the field, there are still limited therapeutic options for treatment or management of the range of dystrophy subtypes. This limitation of viable therapies is due to several key factors: 1) the difficulty of gene therapy strategies, 2) a high frequency of de-novo disease cases and the corresponding lack of translatable animal models, and 3) the lack of rigorous strategies to test the physiological consequences of putative therapeutic agents with clear and reproducible outcome measures.

To overcome some of these limitations, numerous labs including our own are employing zebrafish as a system to model and study human neuromuscular diseases2. To date, zebrafish have proven a valuable tool in disease research. The zebrafish model has been used to identify and validate novel human disease causing mutations16,17, elucidate uncharacterized disease causing mechanisms17,18, and identify novel therapeutic strategies12,19. These advances were made, in part, by the canonical strengths of the zebrafish system such as their optical clarity, ease of genetic manipulation, and ability to breed in large numbers20. Zebrafish have additionally proven amendable to large-scale drug screens21, a valuable method for the identification of novel therapeutics22-24. Regarding muscle disease research, these strengths are complemented by the ability to isolate single zebrafish skeletal muscle fibers via dissociation25 and by the ability to examine myofiber organization in vivo using the optical phenomenon called birefringence26, which collectively allows for rapid determination of macroscopic muscle integrity. Regardless of these available utilities, further tool development is continuously required to advance investigation.

We, and others, have adapted a protocol for EBD injection and analysis in the zebrafish model. EBD is a vital, cell permeable dye that is taken up by damaged, degenerating, or apoptotic cells and then visualized under fluorescence27. To date, EBD analysis has extensively been used to analyze muscle membrane integrity in mouse models of skeletal muscle and heart diseases8,9,27. However, in mammalian preparations, harvested muscle typically requires laborious sectioning or dissection prior to analysis. In zebrafish, direct analysis is possible in high numbers using live and intact animals. In this video article, we will demonstrate the methodology to perform EBD injection and analysis in live zebrafish larvae, with representative images of EBD uptake in the zebrafish dystrophy mutant line sapje15,28. Furthermore, we present a co-injection strategy that allows for increased quantification of EBD preparations.

Protocol

1. Fremstilling af Agar Injection plader (Tid: 45 min) Kog 2% til 3% agarose i E3 medier og lade opløsningen køle lidt på bænken. Bemærk: Antallet af injektion plader forberedes dikterer mængden af ​​agarose påkrævet. Hver injektion plade behov ca. 35 ml af agaroseopløsningen. Efter kogning, tillade agarose afkøle, indtil den ønskede temperatur er nået (f.eks., 45 ° C) som pr sprøjtestøbe producentens anvisninger. Hæld ca. 35 ml af den afkølede agarose i en 100 mm skål. Placer den ene ende af foretrukne sprøjtestøbe i opløsning, derefter lægge resten af ​​mug på agaroseopløsning (dette vil bidrage til at mindske forekomsten af ​​luftbobler). Tillad agaroseopløsningen at størkne enten ved stuetemperatur eller 4 ° C i ca. 30 min. Brug en spatel til at adskille den ene ende af formen fra den faste agarose. Langsomt fjerne resten af ​​m gammel. 2. Fremstilling af Evans blåt farvestof (EBD) Injektion Mix (Tid: 30 min) Lav en bestand 1% af EBD i 1X Ringers opløsning (155 mM NaCl; 5 mM KCI; 2 mM CaCl2; 1 mM MgCI2, 2 mM Na 2 HPO 4; 10 mM HEPES; 10 mM glucose; pH til 7,2), som kan opbevares ved stuetemperatur. Lav en stamopløsning af fluoresceinisothiocyanat (FITC) -dextran MW 10.000 kDa ved 25 mg / ml i 1X Ringers opløsning og opbevares ved -20 ° C. Forbered injektion blanding ved at fortynde EBD til 0,1% direkte i stamopløsning af FITC-dextran lager (dvs. til en sidste arbejdsvolumen på 100 pi:. Bland 10 pi 1% EBD i 90 pi FITC dextran lager). Grundigt vortex injektion mix (det skal blive grøn), og holde sig ude af direkte lys ved at pakke injektion blandingsglasset i alufolie. 3. EBD Injection Forberedelse (Tid: Ca. 30 min) ent "> Bemærk: Protokol fungerer bedst med larver fra 3-7 dage efter befrugtning (DPF). Pre-varme injektionspladen til stuetemperatur. Opsæt injektion ved at arrangere mikromanipulator på metalpladen og stå ved siden mikroskopet anvendes til injektion. Tænd luftdrevet mikroinjektion controller. Bemærk: Den foretrukne indsprøjtningssystemet vil variere fra laboratoriet og må ikke ændre resultatet af analysen. Tilbage fylde kanyle med ca. 2-4 pi EBD mix. Kalibrer injektion volumen til ca. 5 nl af EBD mix. Bemærk: Injektionsvolumen kalibrering vil afhænge af kalibreringsmetode. Et stempel drevet injektion direkte kan indstilles til en given injektionsvolumen henviser gastryk injektorer skal bruge injektionsvolumen kalibreret via volumen bolus med anvendelse af et mikrometer. Våd sprøjtning plade med 1X Ringers opløsning og fjerne overskydende fra brønde. Pre-treat larver med 0,04% ethyl-3-aminobenzoat methanesulfonate salt (tricaine) fortyndet i 1X Ringers opløsning til immobilisering larver før starten af ​​injektionen. Bemærk: Sikring af larver er helt immotile er vigtigt, da korrekt injektion er vanskeligt med enhver resterende bevægelse. Placer bedøvet larver i brønde på agar injektion plader under anvendelse af et glas pipette. Sørg for, at larverne er helt inden for godt og liggende på deres side. Bemærk: Antallet af larver per brønd er op til forsøgslederen. Efter larver er sat i brøndene, fjerne overskydende Ringers opløsning for at minimere larver bevægelse inden i brønden. Efterlad en resterende mængde opløsning, således at larverne ikke dehydrerer. 4. Perikardial Injektion af zebrafisk Larver med EBD (Tid: Afhængig af antal larver intravenøs, anslået 1-3 timer) Placer injektionen plade indeholdende larver på et dissektionsmikroskop hvor injektionerne vil blive udført. Placer injektionspipetten nålen indeholderden EBD mix over en zebrafisk larver. Re-stillingen injektionspladen ved at dreje det så injektionsnålen er nær larver hjerte og ca. 45 ° ventralt fra anterior-posterior akse. Stik injektionskanylen i den fælles cardinal vene (CCV) i området af venen ved den forreste del af blommen, hvor venen indledningsvis drejning i den dorsale retning (figur 1). Bemærk: En forstørrelse på op til 40x kan være nyttige til klart at se CCV. Injicer 5 nl af EBD mix og holde kanylen i position til 5-8 sek for at minimere øjeblikkelig lækage af EBD mix. Bemærk: En god injektion får farvestof farvning ses i hjertekamrene (figur 1). Hvis EBD blanding ikke er observeret i hjertet, derefter injicere yderligere 5 nl af EBD blanding kan være tilstrækkelig til at fremkalde farvestofoptagelse. Alternativt kan embryoet kasseres. Bemærk: I visse situationer kan hjertet op med at slå. Hvis dette occurs, fortsat overvåge larverne til 20-40 sek. Typisk hjertet genoptager slå som farvestoffet bevæger sig gennem kredsløbssystemet. Gå videre til den næste larver og gentag. Identificer succes injicerede embryoner ved at observere tilstedeværelsen af FITC-dextran i vaskulaturen umiddelbart efter injektion (figur 2). 5. Inkubation og EBD Optagelse (Tid: 4-6 timer) Efter det ønskede antal larver injiceres, injiceres tilbagevenden larver til 1X Ringers opløsning uden tricaine i 100 mm skåle. Hold retter indpakket i aluminiumsfolie. Bemærk: Hold injiceret larver i mørke øger overlevelsesrater og sikrer størst sammenhæng i signalstyrke. Indpakning i aluminiumfolie er særligt vigtigt for den tidsperiode, som larverne er uden for inkubatoren. Tillad larver at inkubere ved 28,5 ° C i 4-6 timer for at sikre tilstrækkelig EBD-optagelse. </ol> 6. Visualisering af EBD i muskel (Tid: Afhængig af antal larver intravenøs og typen af ​​mikroskopi, anslået 0,5-3 timer) Forud for billedbehandling, bedøver larverne med 0,04% tricaine at forhindre bevægelse. Vis larver under rød fluorescens at afgøre, om der sker EBD optagelse i skeletmuskel (figur 3).

Representative Results

EBD injektion mix blev injiceret i CCV af sapje homozygote mutanter og vildtype-søskende 3 dpf. Injektioner, der fyldte hjertekamrene (figur 1B) blev derefter analyseret for vellykket injektion ved at visualisere FITC-dextran i vaskulaturen under grøn fluorescens (figur 2). Efter en 4 timers inkubationstid blev EBD optagelse undersøgt på somit niveau ved hjælp af fluorescens mikroskopi. Vildtype søskende udviste ingen EBD fluorescens inden nogen synlige muskelfibre (figur 3A), mens de sapje homozygote mutanter viste EBD optagelse, hvilket indikerer skade på musklen membranen 15 (figur 3B). Figur 1. Injektion EBD injektion mix i den fælles kardinal vene (CCV) af en zebrafisk Embryo. (A) injiceret embryo. Pil betegner ideel beliggenhed for CCV injektion. (B) Vellykket injektion i CCV. Farvestoffet indtræder i hjertekamrene (pil) og begynder at blive pumpet gennem vaskulaturen. (C) En mislykket CCV injektion vil resultere i nogle eller alle af farvestoffet ind i blommesækken af embryo (pil). Venligst klik her for at se en større version af dette tal. Figur 2. Embryoner kan sorteres for vellykket injektion ved at observere FITC-dextran distribution under grøn fluorescens hele vaskulaturen umiddelbart efter injektion og før EBD-optagelse.Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 3: EBD vil blive taget op af fibre med beskadigede membraner (A) vildtype søskende viser ingen EBD fluorescens i muskelfibre.. (B) Sapje ​​homozygot mutant med EBD fluorescens inden flere muskelfibre (pile). Alle larver blev injiceret med EBD injektion mix og analyseret efter en 4 timers inkubationsperiode ved 3 dpf. Søskende og mutanter blev sorteret efter muskelfiber løsrivelse før CCV injektion. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Zebrafisk dukker op som et effektivt redskab til studiet af neuromuskulære sygdomme 2,29. Til dato har zebrafisk system, blevet brugt til at validere nye muskel sygdomsfremkaldende mutationer 16,17,30, belyse nye patomekanismer 18, og identificere potentielle nye terapeutiske lægemidler 12,24. Disse kollektive indsats har etableret nytten af ​​zebrafisk til at modellere menneskelige neuromuskulære sygdomme. Men på trods af de fremskridt med zebrafisk og pattedyr modeller, der er begrænsede behandlingsmuligheder for patienter inden for det brede spektrum af neuromuskulære forhold. Der eksisterer derfor for terapiudvikling for denne gruppe af ødelæggende sygdomme en stor efterspørgsel. Parallelt denne efterspørgsel efter lægemidler er den tilsvarende behov for løbende eksperimenterende innovation, samt grundig analyse for at kontrollere nye dyremodeller og formodede terapeutiske strategier.

EBD-analyse er almindeligt anvendt i musemodeller tilundersøgelse væv og cellulære skader i hjerne, hjerte og skeletmuskulatur 27,31. Mest bemærkelsesværdigt er EBD udbredt i musemodeller af forskellige muskeldystrofi undertyper at vise sværhedsgraden af muskelmembranernes ustabilitet og beskadige 8. Anvendelsen af EBD at afsløre skader muskelmembranernes er en støttende parameter oprettelse ligheder i dyremodel for det menneskelige sygdomstilstand 9. Effekten af ​​EBD i mus har fået flere laboratorier, herunder vores egen, at udvikle og anvende EBD til zebrafisk modeller af neuromuskulære sygdomme. På grund af anvendeligheden af EBD-analyse, er denne teknik aktivt at blive gennemført for at underbygge zebrafisk modeller til den menneskelige sygdomstilstand 11,15,22,24,32. Larver med beskadigede muskel membraner vil have EBD optagelse og derfor rød fluorescens inden muskelfibre. Fluorescens observeret i den inter-fiber plads, men ikke inden for de enkelte muskelfibre kan også være informativ af fibre aftagning fra basalmembranen i tHan fravær af skader membran, giver nyttige diagnostisk detaljer. EBD-analyse har potentiel anvendelse ud over validering dyremodel. Indsats fra vores laboratorium har for nylig vist, at EBD analyse er gavnlige i at validere potentielt nye terapeutiske lægemidler 24. Bestemmelse om potentielle terapeutiske behandlinger reducere eller afskaffe EBD optagelse i neuromuskulære sygdomsmodeller kan betyde relevant terapeutisk virkning 8. Denne type analyse kan hjælpe med at etablere mekanismen (e) af lægemidler og udvider anvendelsen af ​​EBD-analyse.

Som med mange teknikker, er EBD-analyse har flere forbehold, der skal overholdes under eksperimentelle design og praksis. For eksempel kan det være en udfordring at identificere CCV grund af fortykkelse af vævet med alderen. Desuden er det let at beskadige larver som forberedelse før og under perikardial injektion reducere eksperimentelle tæller og øger behovet for at prep store antal larver.Endvidere kunne fysisk skade gjort for at larverne under håndtering og injektion resultere i falske positiver, som beskadigede muskel kan tage op EBD. For at overvinde nogle af disse hindringer, har vi beskrevet en co-injektion strategi i denne video artikel, der gør det nemt og pålidelig identifikation af larver med succes farvestof infusion umiddelbart efter injektion og før efterfølgende analyse. FITC-dextran Saminjektion kontrol for vellykket injektion ved at tillade bekræftelse af EBD i vaskulaturen før dens optagelse af muskelfibrene. Dette kan især være nyttigt som EBD fluorescens bliver meget diffus i larver efter flere timer, hvis ikke indsamlet i muskelfibrene; som sådan, kan det være vanskeligt at opdage. Desuden mangler CCV og injektion EBD i æggeblomme eller legemshulrum kan, efter inkubation, medføre diffus rød fluorescens ligner kontrollere embryoner, men med reduceret sandsynlighed for optagelse af beskadigede muskelfibre. Kollektivt, disse grotteATS tyder EBD injektion kræver tålmodighed og praksis for at opnå konsistente og pålidelige resultater.

I alt beskriver vi en praktisk og enkel metode til at udføre EBD analyse på zebrafisk larver. Til dato anvendelsen af ​​zebrafisk som et modelsystem, især som en menneskelig sygdom model, er hastigt voksende. Denne ekspansion er delvist på grund af den fortsatte udvikling og ændring af eksperimentelle teknikker, der forbedrer på de nuværende fordele ved zebrafisk system. Den EBD injektionsteknik giver en ekstra og kraftfuldt værktøj til en forsker arsenal for validering og studiet af zebrafisk muskel sygdomsmodeller. Den igangværende gennemførelse og ændring af denne teknik har potentiale til at bidrage til at belyse nye terapeutiske strategier samt sygdom forårsager mekanismer.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi vil gerne takke Trent Waugh for hans teknisk bistand. Vi anerkender også Department of Pediatrics på Hospital for Sick Children og Cure medfødt muskeldystrofi (CMD) for deres generøse støtte til dette projekt.

Materials

Fluorescein isothiocyanate-dextran MW 10,000 Sigma FD10S
Evan's Blue Dye Sigma E2129
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt Sigma A5040
100 mm Petri dish Fischerbrand FB0875712 Injection mold base
Thin wall glass capillaries World Precision Instruments TW100F-4 For Injection needle
Agarose Bioshop AGA001 Injection mold
Microinjection mold Adaptive Science Tools TU-1 Injection mold
Sodium chloride Bioshop SOD001 Ringer's solution
Potassium chloride Bioshop POC888 Ringer's solution
Magnessium chloride hexahydrate Sigma M2670 Ringer's solution
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma S9638 Ringer's solution
HEPES Sigma H4034 Ringer's solution
Glucose BioBasic GB0219 Ringer's solution
Calcium chloride Sigma C1061 Ringer's solution
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Verma, S., Anziska, Y., Cracco, J. Review of Duchenne muscular dystrophy (DMD) for the pediatricians in the community. Clin Pediatr (Phila. 49, 1011-1017 (2010).
  2. Gibbs, E. M., Horstick, E. J., Dowling, J. J. Swimming into prominence: the zebrafish as a valuable tool for studying human myopathies and muscular dystrophies). FEBS J. 280, 4187-4197 (2013).
  3. Lancet, . , 381-845 (2013).
  4. Lapidos, K. A., Kakkar, R., McNally, E. M. The dystrophin glycoprotein complex: signaling strength and integrity for the sarcolemma. Circ Res. 94, 1023-1031 (2004).
  5. Campbell, K. P., Kahl, S. D. Association of dystrophin and an integral membrane glycoprotein. Nature. 338, 259-262 (1989).
  6. Cohn, R. D., Campbell, K. P. Molecular basis of muscular dystrophies. Muscle Nerve. 23, 1456-1471 (2000).
  7. Yoshida, M., Ozawa, E. Glycoprotein complex anchoring dystrophin to sarcolemma. J Biochem. 108, 748-752 (1990).
  8. Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption. J Cell Biol. 139, 375-385 (1997).
  9. Matsuda, R., Nishikawa, A., Tanaka, H. Visualization of dystrophic muscle fibers in mdx mouse by vital staining with Evans blue: evidence of apoptosis in dystrophin-deficient muscle. J Biochem. 118, 959-964 (1995).
  10. Bassett, D., Currie, P. D. Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy. Clin Exp Pharmacol Physiol. 31, 537-540 (2004).
  11. Gupta, V., et al. The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies. Hum Mol Genet. 20, 1712-1725 (2011).
  12. Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5331-5336 (2011).
  13. Guyon, J. R., et al. Modeling human muscle disease in zebrafish. Biochim Biophys Acta. 1772, 205-215 (2007).
  14. Cavanna, J. S., et al. Molecular and genetic mapping of the mouse mdx locus. Genomics. 3, 337-341 (1988).
  15. Bassett, D. I., et al. Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo. Development. 130, 5851-5860 (2003).
  16. Horstick, E. J., et al. Stac3 is a component of the excitation-contraction coupling machinery and mutated in Native American myopathy. Nat Commun. 4, (1952).
  17. Davidson, A. E., et al. Novel deletion of lysine 7 expands the clinical, histopathological and genetic spectrum of TPM2-related myopathies. Brain. 136, 508-521 (2013).
  18. Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. Neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation. Dis Model Mech. 5, 389-396 (2012).
  19. Dowling, J. J., et al. Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy. Brain. 135, 1115-1127 (2012).
  20. Detrich, H. W., Westerfield 3rd, ., M, L. I., Zon, . Overview of the Zebrafish system. Methods Cell Biol. 59, 3-10 (1999).
  21. Whitfield, T. T., et al. Mutations affecting development of the zebrafish inner ear and lateral. , 123-241 (1996).
  22. Kawahara, G., Guyon, J. R., Nakamura, Y., Kunkel, L. M. Zebrafish models for human FKRP muscular dystrophies. Hum Mol Genet. 19, 623-633 (2010).
  23. Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nat Commun. 4, (2013).
  24. Waugh, T. A., et al. Fluoxetine prevents dystrophic changes in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Hum Mol Genet. 23 (17), 4651-4662 .
  25. Horstick, E. J., Gibbs, E. M., Li, X., Davidson, A. E., Dowling, J. J. Analysis of embryonic and larval zebrafish skeletal myofibers from dissociated preparations. J Vis Exp. 50259, (2013).
  26. Smith, L. L., Beggs, A. H., Gupta, V. A. Analysis of skeletal muscle defects in larval zebrafish by birefringence and touch-evoke escape response assays. J Vis Exp. 50925, (2013).
  27. Hamer, P. W., McGeachie, J. M., Davies, M. J., Grounds, M. D. Evans Blue Dye as an in vivo. marker of myofibre damage: optimising parameters for detecting initial myofibre membrane permeability. J Anat. 200, 69-79 (2002).
  28. Guyon, J. R., et al. Genetic isolation and characterization of a splicing mutant of zebrafish dystrophin. Hum Mol Genet. 18, 202-211 (2009).
  29. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).
  30. Majczenko, K., et al. Dominant Mutation of CCDC78 in a Unique Congenital Myopathy with Prominent Internal Nuclei and Atypical Cores. Am J Hum. , (2012).
  31. Wooddell, C. I., et al. Use of Evans blue dye to compare limb muscles in exercised young and old mdx mice. Muscle Nerve. 41, 487-499 (2010).
  32. Hall, T. E., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 7092-7097 (2007).

Tags

ZebrafishLarvaeSkeletal MuscleIntegrityEvans Blue DyeNeuromuscular DisordersMuscle MembraneMuscular DystrophyLive ImagingCo-injection

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Smith, S. J., Horstick, E. J., Davidson, A. E., Dowling, J. Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye. J. Vis. Exp. (105), e53183, doi:10.3791/53183 (2015).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image