ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע
Summary
In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.
Abstract
The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.
Introduction
Muscular dystrophies constitute a group of prevalent and heterogeneous human muscle diseases with specific histopathological features1,2. Symptoms typically associated with this devastating group of diseases include muscle weakness, muscle degeneration, loss of motility, and early mortality1,3. The primary pathomechanisms of muscular dystrophies are the loss of proteins that stabilize the sarcolemma, anchor transmembrane complexes, and mediate cell signaling across the membrane4-6. For example, complete loss of the protein dystrophin, a primary scaffold protein of the dystrophin-glycoprotein complex, results in destabilization of the muscle membrane in Duchenne muscular dystrophy7. Due to the fact that most muscular dystrophies result from mutations in proteins that participate in the link between the extracellular matrix and the sarcolemmal cytoskeleton, a common observation at the cellular level is the loss of sacrolemmal integrity8,9. This understanding of the primary pathomechanism(s) associated with muscular dystrophies is the product of numerous years of research employing animal model systems2,10-15. However, despite advances in the field, there are still limited therapeutic options for treatment or management of the range of dystrophy subtypes. This limitation of viable therapies is due to several key factors: 1) the difficulty of gene therapy strategies, 2) a high frequency of de-novo disease cases and the corresponding lack of translatable animal models, and 3) the lack of rigorous strategies to test the physiological consequences of putative therapeutic agents with clear and reproducible outcome measures.
To overcome some of these limitations, numerous labs including our own are employing zebrafish as a system to model and study human neuromuscular diseases2. To date, zebrafish have proven a valuable tool in disease research. The zebrafish model has been used to identify and validate novel human disease causing mutations16,17, elucidate uncharacterized disease causing mechanisms17,18, and identify novel therapeutic strategies12,19. These advances were made, in part, by the canonical strengths of the zebrafish system such as their optical clarity, ease of genetic manipulation, and ability to breed in large numbers20. Zebrafish have additionally proven amendable to large-scale drug screens21, a valuable method for the identification of novel therapeutics22-24. Regarding muscle disease research, these strengths are complemented by the ability to isolate single zebrafish skeletal muscle fibers via dissociation25 and by the ability to examine myofiber organization in vivo using the optical phenomenon called birefringence26, which collectively allows for rapid determination of macroscopic muscle integrity. Regardless of these available utilities, further tool development is continuously required to advance investigation.
We, and others, have adapted a protocol for EBD injection and analysis in the zebrafish model. EBD is a vital, cell permeable dye that is taken up by damaged, degenerating, or apoptotic cells and then visualized under fluorescence27. To date, EBD analysis has extensively been used to analyze muscle membrane integrity in mouse models of skeletal muscle and heart diseases8,9,27. However, in mammalian preparations, harvested muscle typically requires laborious sectioning or dissection prior to analysis. In zebrafish, direct analysis is possible in high numbers using live and intact animals. In this video article, we will demonstrate the methodology to perform EBD injection and analysis in live zebrafish larvae, with representative images of EBD uptake in the zebrafish dystrophy mutant line sapje15,28. Furthermore, we present a co-injection strategy that allows for increased quantification of EBD preparations.
Protocol
Representative Results
Discussion
דג הזברה הם מתעוררים ככלי רב עוצמה לחקר מחלה עצבית-שרירית 2,29. עד כה, מערכת דג הזברה נעשתה שימוש כדי לאמת את המוטציות הגורמות למחל שריר חדש 16,17,30, להבהיר pathomechanisms רומן 18, ולזהות תרופות טיפוליות פוטנציאלי חדשות 12,24. מאמצים הקולקטיביים אלה הקימו את השירות של דג הזברה מודל מחלות עצבית-שרירית אנושיות. עם זאת, למרות ההתקדמות שנעשתה עם מודלים דג הזברה ויונקים, יש אפשרויות טיפול מוגבלות לחולים בתוך הספקטרום הרחב של מצבים עצבית-שרירית. לכן, דרישה גבוהה קיימת לפיתוח טיפול לקבוצה זו של מחלות הרסניות. במקביל לדרישה זו לתרופות הוא הצורך המקביל לחדשנות מתמשכת ניסיונית, כמו גם ניתוח קפדני כדי לוודא מודלים של בעלי חיים חדשים ואסטרטגיות טיפוליות המשוערות.
ניתוח EBD משמש בדרך כלל במודלים של עכברים לרקמת מחקר ונזק לתאים במוח, לב, ו27,31 שרירי שלד. בעיקר, EBD נעשה שימוש נרחב במודלים של עכברים של תת ניוון שרירים שונים כדי להראות את החומרה של חוסר יציבות קרום שריר וניזק 8. השימוש בEBD לחשוף נזק קרום שריר הוא פרמטר תומך הקמת דמיון של מודל החיה למצב המחלה האנושי 9. כוחו של EBD בעכבר הוביל כמה מעבדות, כוללים שלנו, לפתח וליישם EBD לדגמי דג הזברה של מחלה עצבית-שרירית. בשל תחולתו של ניתוח EBD, טכניקה זו מיושמת באופן פעיל כדי לאשש דגמי דג הזברה למצב המחלה האנושי 11,15,22,24,32. זחלים עם ממברנות שריר פגועות יהיו ספיגת EBD וקרינה לכן אדומה בתוך סיבי שריר. הקרינה שנצפתה בחלל הבין-סיבים, אך לא בתוך סיבי שריר בודדים יכולה להיות גם להיות אינפורמטיבי של סיבי ניתוק מהקרום במרתף בtהוא היעדר נזק קרום, מתן פירוט אבחון שימושי. יש ניתוח EBD יישום פוטנציאל מעבר אימות מודל חיה. מאמצים מהמעבדה שלנו הוכיחו לאחרונה כי ניתוח EBD מועיל באימות תרופות טיפוליות פוטנציאלי רומן 24. קביעה אם טיפולים טיפוליים פוטנציאל להפחית או לבטל ספיגת EBD במודלי מחלה עצבית-שרירית יכולים לסמן פעולה טיפולית רלוונטית 8. סוג זה של ניתוח יכול לעזור להקים את המנגנון (ים) של תרופות ומרחיב את היישום של ניתוח EBD.
כמו בטכניקות רבות, ניתוח EBD יש לי כמה אזהרות שנצפו במהלך עיצוב ובפועל ניסיוניים. לדוגמא, זה יכול להיות מאתגר לזהות CCV בשל העיבוי של הרקמות עם גיל. בנוסף, קל לפגוע זחלים בהכנה לפני ובמהלך הזרקת קרום הלב, הפחתת ספירה ניסיונית והגדלת הצורך מכין מספר גדול של זחלים.יתר על כן, נזק פיזי שנגרם לזחלים במהלך טיפול והזרקה עלול לגרום לתוצאות חיוביות שגויות כמו שריר שנפגע יכול לקחת עד EBD. על מנת להתגבר על חלק מהמכשולים הללו, שתארנו את אסטרטגית שיתוף הזרקה במאמר זה וידאו, המאפשר זיהוי קל ואמין של זחלים עם עירוי צבע מוצלח מייד לאחר הזרקה ולפני ניתוח שלאחר מכן. FITC-dextran בקרות שיתוף הזרקה להזרקה מוצלחת על ידי מתן אישור של EBD בכלי הדם לפני ספיגתו על ידי סיבי השריר. זה יכול להיות שימושי במיוחד כקרינת EBD הופכת מפוזרת מאוד בזחלים לאחר כמה שעות אם לא נאסף בסיבי השריר; ככזה, הוא יכול להיות קשה לזהות. בנוסף, חסר CCV והזרקת EBD לתוך חלל החלמון או גוף יכול, לאחר דגירה, לגרום לקרינה אדומה מפוזרת דומה לשלוט עוברים, עדיין עם הסיכוי המופחת של ספיגה על ידי סיבי שריר פגועים. באופן קולקטיבי, מערה אלהATS מציע הזרקת EBD דורשת סבלנות ותרגול כדי להשיג תוצאות עקביות ואמינות.
בסך הכל, אנו מתארים שיטה מעשית ופשוטה לביצוע ניתוח EBD על זחלי דג הזברה. נכון להיום, השימוש בדג הזברה כמערכת מודל, במיוחד כמודל מחלה אנושי, כבר מתרחב במהירות. הרחבה זו היא באופן חלקי בשל הפיתוח והשינוי המתמשכים של שיטות ניסיוניות שלשפר את היתרונות הנוכחיים של מערכת דג הזברה. טכניקת הזרקת EBD מספקת כלי נוסף ורב עוצמה לארסנל של חוקר לאימות והמחקר של מודלים מחלת שריר דג הזברה. יש יישום והשינוי המתמשך של טכניקה זו יש הפוטנציאל לסייע לחשוף אסטרטגיות טיפוליות חדשניות, כמו גם מנגנוני מחלה גורמת.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות טרנט וו לקבלת הסיוע הטכני שלו. אנחנו גם מכירים מחלקת הילדים בבית החולים לילדים וקיור מולדים ניוון שרירים (CMD) למימון הנדיב שלהם לפרויקט זה.
Materials
| Fluorescein isothiocyanate-dextran MW 10,000 | Sigma | FD10S | |
| Evan's Blue Dye | Sigma | E2129 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma | A5040 | |
| 100 mm Petri dish | Fischerbrand | FB0875712 | Injection mold base |
| Thin wall glass capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | For Injection needle |
| Agarose | Bioshop | AGA001 | Injection mold |
| Microinjection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | Injection mold |
| Sodium chloride | Bioshop | SOD001 | Ringer's solution |
| Potassium chloride | Bioshop | POC888 | Ringer's solution |
| Magnessium chloride hexahydrate | Sigma | M2670 | Ringer's solution |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | Ringer's solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | Ringer's solution |
| Glucose | BioBasic | GB0219 | Ringer's solution |
| Calcium chloride | Sigma | C1061 | Ringer's solution |
Referências
- Verma, S., Anziska, Y., Cracco, J. Review of Duchenne muscular dystrophy (DMD) for the pediatricians in the community. Clin Pediatr (Phila. 49, 1011-1017 (2010).
- Gibbs, E. M., Horstick, E. J., Dowling, J. J. Swimming into prominence: the zebrafish as a valuable tool for studying human myopathies and muscular dystrophies). FEBS J. 280, 4187-4197 (2013).
- Lancet, . , 381-845 (2013).
- Lapidos, K. A., Kakkar, R., McNally, E. M. The dystrophin glycoprotein complex: signaling strength and integrity for the sarcolemma. Circ Res. 94, 1023-1031 (2004).
- Campbell, K. P., Kahl, S. D. Association of dystrophin and an integral membrane glycoprotein. Nature. 338, 259-262 (1989).
- Cohn, R. D., Campbell, K. P. Molecular basis of muscular dystrophies. Muscle Nerve. 23, 1456-1471 (2000).
- Yoshida, M., Ozawa, E. Glycoprotein complex anchoring dystrophin to sarcolemma. J Biochem. 108, 748-752 (1990).
- Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption. J Cell Biol. 139, 375-385 (1997).
- Matsuda, R., Nishikawa, A., Tanaka, H. Visualization of dystrophic muscle fibers in mdx mouse by vital staining with Evans blue: evidence of apoptosis in dystrophin-deficient muscle. J Biochem. 118, 959-964 (1995).
- Bassett, D., Currie, P. D. Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy. Clin Exp Pharmacol Physiol. 31, 537-540 (2004).
- Gupta, V., et al. The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies. Hum Mol Genet. 20, 1712-1725 (2011).
- Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5331-5336 (2011).
- Guyon, J. R., et al. Modeling human muscle disease in zebrafish. Biochim Biophys Acta. 1772, 205-215 (2007).
- Cavanna, J. S., et al. Molecular and genetic mapping of the mouse mdx locus. Genomics. 3, 337-341 (1988).
- Bassett, D. I., et al. Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo. Development. 130, 5851-5860 (2003).
- Horstick, E. J., et al. Stac3 is a component of the excitation-contraction coupling machinery and mutated in Native American myopathy. Nat Commun. 4, (1952).
- Davidson, A. E., et al. Novel deletion of lysine 7 expands the clinical, histopathological and genetic spectrum of TPM2-related myopathies. Brain. 136, 508-521 (2013).
- Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. Neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation. Dis Model Mech. 5, 389-396 (2012).
- Dowling, J. J., et al. Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy. Brain. 135, 1115-1127 (2012).
- Detrich, H. W., Westerfield 3rd, ., M, L. I., Zon, . Overview of the Zebrafish system. Methods Cell Biol. 59, 3-10 (1999).
- Whitfield, T. T., et al. Mutations affecting development of the zebrafish inner ear and lateral. , 123-241 (1996).
- Kawahara, G., Guyon, J. R., Nakamura, Y., Kunkel, L. M. Zebrafish models for human FKRP muscular dystrophies. Hum Mol Genet. 19, 623-633 (2010).
- Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nat Commun. 4, (2013).
- Waugh, T. A., et al. Fluoxetine prevents dystrophic changes in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Hum Mol Genet. 23 (17), 4651-4662 .
- Horstick, E. J., Gibbs, E. M., Li, X., Davidson, A. E., Dowling, J. J. Analysis of embryonic and larval zebrafish skeletal myofibers from dissociated preparations. J Vis Exp. 50259, (2013).
- Smith, L. L., Beggs, A. H., Gupta, V. A. Analysis of skeletal muscle defects in larval zebrafish by birefringence and touch-evoke escape response assays. J Vis Exp. 50925, (2013).
- Hamer, P. W., McGeachie, J. M., Davies, M. J., Grounds, M. D. Evans Blue Dye as an in vivo. marker of myofibre damage: optimising parameters for detecting initial myofibre membrane permeability. J Anat. 200, 69-79 (2002).
- Guyon, J. R., et al. Genetic isolation and characterization of a splicing mutant of zebrafish dystrophin. Hum Mol Genet. 18, 202-211 (2009).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).
- Majczenko, K., et al. Dominant Mutation of CCDC78 in a Unique Congenital Myopathy with Prominent Internal Nuclei and Atypical Cores. Am J Hum. , (2012).
- Wooddell, C. I., et al. Use of Evans blue dye to compare limb muscles in exercised young and old mdx mice. Muscle Nerve. 41, 487-499 (2010).
- Hall, T. E., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 7092-7097 (2007).
