Bacterial Artificial Chromosomes: uno strumento Genomica Funzionale per lo studio di positivo-strand virus RNA

Nota: la figura 1 illustra una strategia per la costruzione di un full-length infettiva ICE cDNA come BAC 28 tabella 1 fornisce un elenco degli oligonucleotidi utilizzati in questo protocollo 28.. 1. Estrarre l'RNA virale da particelle JEV in Cell Culture Supernatant Inizia con il mezzo di coltura cellulare contenente ICE SA 14 -14-2, un live virus vaccinale JE che richiede livello di biosicurezza 2 contenimento. Nota: Il titolo virale è di circa 1-3 × 10 6 unità formanti placca / ml. Prendete la formazione biosicurezza necessaria per tutte le pratiche standard microbiologici, apparecchiature di sicurezza e strutture di laboratorio prima di lavorare con ICE SA 14 -14-2. Purificare RNA virale da un'aliquota del medium di coltura cellulare contenente il virus usando una soluzione monofasica di fenolo e guanidina isotiocianato 66 (Figura 1A). Anno Dominid 600 ml di reagente monofasica a 200 ml di supernatante di coltura in una provetta 1,7 ml. Omogeneizzare la miscela mano-agitando la provetta vigorosamente per 30 secondi e incubando per 5 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 160 ml di cloroformio al campione omogeneizzato. Mescolare accuratamente a mano, agitando la provetta vigorosamente per 15 secondi e lasciarla riposare per 2-3 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare il lisato totale a 13.400 xg per 15 min a 4 ° C, che si traduce in una separazione delle due fasi liquide, cioè una fase organica inferiore e una fase acquosa superiore. Trasferire la fase acquosa superiore (inferiore a 200 microlitri) contenente l'RNA ad una nuova provetta. Precipitare il RNA aggiungendo 1 ml di 5 mg / ml di glicogeno e 400 ml di isopropanolo al 100% e incubando per 10 minuti a RT. Centrifugare la miscela a 13.400 xg per 10 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante e lavare il pellet di RNA con 1 ml di etanolo al 75% da polso-vortex 04:57tempi e centrifugazione a 13.400 xg per 5 minuti a 4 ° C. Asciugare il pellet di RNA per 10 minuti e si dissolvono in 40 ml di dH 2 O. Conservare il RNA estratto a -80 ° C fino al momento dell'uso. 2. Sintetizzare una serie di quattro sovrapposizione cDNA Fragments (da F1 a F4) che abbracciano l'intera Viral Genomic RNA trascrizione inversa (RT) -PCR Eseguire 20 microlitri reazione RT con una aliquota di 10 microlitri di RNA virale purificato come modello e una forma modificata del virus della leucemia murina Moloney trascrittasi inversa. 67 Impostare una miscela di 13 ml contenente 10 ml di RNA purificato, 1 ml 10 mM dNTP mix, 1 ml 4 pmol / primer ml e 1 ml dH 2 O. Utilizzare il primer specifico per frammento per ogni reazione RT: 1RT per la F1, 2RT per F2, 3RT per F3 e F4 per 4RT. Incubare la miscela a 65 ° C per 5 min, posto in ghiaccio per 1 min, e quindi rapida rotazione per raccogliere il contenti sul fondo della provetta. Aggiungere 4 ml 5 × tampone RT, 1 ml 0.1 M DTT, 1 inibitore RNase ml 40 U / ml, e 1 ml 200 U / ml trascrittasi inversa. Mescolare pipettando su e giù tre a cinque volte. Sia la reazione procede a 50 ° C per 1 ora, quindi calore inattivare il campione a 70 ° C per 15 min. Conservare il cDNA sintetizzato primo filamento a -20 ° C fino al momento dell'uso. Eseguire 100 microlitri reazione PCR con una aliquota di 5 microlitri del inattivato al calore di reazione RT come modello e un alta fedeltà DNA polimerasi termostabile 68 (Figura 1B). Impostare un 100 microlitri reazione PCR in ghiaccio, contenente 5 ml di reazione RT, 20 microlitri 5 × tampone PCR, 4 microlitri 10 mM miscela dNTP, 5 ml 10 micron di primer in avanti, 5 ml 10 micron primer reverse, 1 ml 2 U / DNA polimerasi ml e 60 ml dH 2 O. Utilizzare la coppia di primer specifici per ogni frammento reactio PCRn: 1F + 1R per la F1 (2573 bp), 2F + 2R per F2 (4171 bp), 3F + 3R per F3 (3922 bp) e 4F + 4R per F4 (1798 bp). Mescolare delicatamente tre a cinque volte dita lanciando provetta e centrifugare brevemente per raccogliere il contenuto sul fondo. Iniziare con un ciclo termico denaturazione iniziale di 30 sec a 98 ° C, seguita da 25-30 cicli con il seguente profilo PCR: 10 sec a 98 ° C, 30 sec a 60 ° C, e 1-2 min (30 s / kb) a 72 ° C. Conservare i prodotti di PCR a 4 ° C fino al momento dell'analisi. Eseguire un'aliquota 2-5 pl di ciascuna reazione di PCR su un gel di agarosio 0,8% contenente 0,5 mg / ml di etidio bromuro (EtBr) (Figura 2). ATTENZIONE: EtBr è un potente mutageno e richiede camici, occhiali di sicurezza e guanti da indossare e la massima attenzione da osservare durante l'uso, lo stoccaggio e lo smaltimento. 3. subclone Ognuno dei quattro cDNA Fragments (da F1 a F4) in un vettore BAC per la creazione PBAC / F1 a PBAC / F4 bTecniche y clonazione molecolare Digest il vettore e inserire DNA con due opportuni enzimi di restrizione, come segue: Eseguire una digestione sequenziale di PBAC / PRRSV / FL (vettore), 30 un derivato del plasmide pBeloBAC11 (7507 bp, GenBank numero di accesso U51113), con Pme io e non io in un volume totale di 60 microlitri (contenente ~ 500 DNA ng , 10 U dell'enzima, tampone di digestione 1x, e 1 × BSA) a 37 ° C per 12-15 ore, da cui si ricava il frammento vettoriale 15426 bp. Eseguire la digestione sequenziale di ciascuna delle quattro ampliconi cDNA (inserto) con Sma I e Not I in un volume totale di 60 microlitri (contenenti ~ 1 ug di DNA, 20 U dell'enzima, 1 × tampone di digestione, e 1 × BSA) a 25 ° C (Sma I) o 37 ° C (Not I) per 12-15 ore, che produce i seguenti frammenti di inserimento della dimensione desiderata: F1 (2559 bp), F2 (4157 bp), F3 (3908 bp), e F4 (1784 bp). Purificare ildesiderato vettore ed inserire frammenti di DNA mediante estrazione gel. Separare i prodotti doppiamente digeriti su un basso punto di fusione gel di agarosio 1% punto contenente 0,5 mg / ml EtBr. Tagliare una banda del frammento di DNA desiderato con una quantità minima di agarosio (di solito ~ 200 microlitri) sotto luce ultravioletta a onda lunga. Aggiungere un volume uguale di tampone TEM (10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, 10 mM MgCl e 2) alla asportato agarosio in una microprovetta 1,7 ml. Incubare il campione a 72 ° C per 10-15 minuti, con vortex ogni 2-3 minuti fino a quando l'agarosio si è completamente sciolto. Aggiungere un uguale volume di pre-riscaldato fenolo tampone saturo, vortex vigorosamente per 1 min, e centrifugare a 13.400 g per 10 minuti a temperatura ambiente. Nota: La miscela si separa in una fase organica inferiore e una fase acquosa superiore. Trasferire la fase acquosa superiore contenente il DNA di una nuova provetta. Aggiungere un uguale volume di cloroformio: alcool isoamilico (24: 1), vortex per 1 min, e centrifugare a 13,400 g per 10 minuti a temperatura ambiente. Trasferire la fase acquosa superiore ad una nuova provetta. Aggiungere 0,5 ml di 10 ug tRNA di lievito / microlitro, 1/10 volume di 3 M acetato di sodio e 2,5 volumi di etanolo al 100%. Mantenere la miscela in ghiaccio per 20 min. Centrifugare la miscela a 13.400 g per 10 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e lavare il pellet di DNA con 1 ml di etanolo al 70% da impulsi vortex tre a cinque volte e centrifugazione a 13.400 xg per 10 min. Far asciugare il pellet di DNA per 10 min e scioglierli in 20 ml di tampone TE (10 mM Tris-Cl e 1 mM EDTA [pH 7,6]). Legare il vettore desiderato e inserire frammenti di DNA utilizzando DNA ligasi T4. Impostare una reazione legatura 20 microlitri contenente 50-100 ng del DNA vettoriale, un eccesso molare ~ 3 volte del DNA dell'inserto, 400 T4 DNA ligasi U, e 1 × tampone legatura. Incubare la reazione legatura a 16 ° C per 12-15 ore. Nota: Includere un contr negativoolo reazione, cioè, vector solo senza l'inserto, in parallelo. Eseguire quattro legature distinte, ciascuna adesione 15426 bp Pme I- Non ho frammento di PBAC / PRRSV / FL con il 2559 bp (F1), 4157-bp (per F2), 3908-bp (per F3), o 1784-bp (F4) Sma I-Not I frammento di uno dei quattro ampliconi cDNA, per generare subcloni PBAC / F1 a PBAC / F4. Trasforma il DNA legatura in E. coli DH10B con il metodo scossa -Heat CaCl 2. Prendete aliquote di 100 ml di CaCl 2 -treated cellule DH10B competenti 69 conservati a -80 ° C e scongelare su ghiaccio. Nota: Utilizzare 100 ml di cellule per trasformazione. Aggiungere una aliquota di 10 ml di reazione legatura DNA per 100 ml di cellule scongelati in una provetta 1,7 ml, mescolare delicatamente toccando il tubo, e tenere in ghiaccio per 30 min. Shock termico la miscela DNA-cella per 45 secondi in un 42 ° C waBagno ter, posto in ghiaccio per 2 minuti, quindi aggiungere 900 ml di brodo LB pre-riscaldato a RT. Incubare le cellule calore scioccato a 35 ° C per 1 ora, con agitazione a 225-250 rpm. Stendere 50 a 200 aliquote microlitri delle cellule in coltura su piastre di agar LB contenenti 10 mg / ml di cloramfenicolo (CML). Tenere le piastre a temperatura ambiente, a destra rivolto verso l'alto, fino a quando sono asciutti. Ruotare le piastre capovolto e incubare a 35 ° C per 15 h. Recuperare il DNA BAC clonato dalle cellule ospiti con un metodo di purificazione basata su colonne (Figura 1C). Scegli da sei a otto colonie batteriche dalle piastre di agar LB-Cml e inoculazione in 3 ml di brodo 2xYT contenenti 10 mg / ml Cml. Incubare le colture a 35 ° C per 10 ore con agitazione vigorosa (225-250 rpm). Isolare ricombinante BAC DNA 1-1,5 ml delle colture batteriche con colonne di rotazione, come indicato dal produttore. 70 Eluire il DNA estratto (typicamente 100-200 ng) in 20 ml di tampone TE. Eseguire due analitiche digestioni dell'enzima di restrizione dei BAC isolati per ~ 6 ore in un volume totale di 10 microlitri, di identificare la presenza del vettore con una corretta inserto utilizzando gli stessi enzimi utilizzati per la clonazione (vedi protocollo 3.1), e l'altra per verificare l'integrità dei BAC clonati con un enzima appropriato (ad esempio, Bgl II, Nco I o Pst I), generando un frammento di restrizione unico modello. Propagare le BAC clonati correttamente inoculando 500 ml di colture batteriche positive (da protocollo 3.5.1) in 500 ml di 2xYT-Cml medio e coltivando l'inoculo per 6 ore a 35 ° C agitando a 225-250 rpm. Purificare il DNA BAC (tipicamente 10-20 ug) dalla cultura 500 ml utilizzando colonne di filtro, come raccomandato dal produttore. 71 Nota: I primi quattro sottocloni BAC, ciascuna contenente un frammento di cDNA di ICE RNA genomico, può rivelarsi di avere sue o più mutazioni indesiderate (s) rispetto alla sequenza di consenso del genoma virale 42 (che serve come sequenza di riferimento). Qualsiasi tale mutazione deve essere corretto dalla società PCR mutagenesi sito-diretta prima dell'assemblaggio di un full-length cDNA ICE. 27 4. Creare un full-length ICE cDNA con il 5 'SP6 promotore e il 3' run-off del sito Fai tre modifiche genetiche (vedi sotto Protocolli 4.1.1-4.1.3) nei cDNA clonati per consentire la trascrizione in vitro run-off di RNA genoma di lunghezza con l'autentico 5 'e 3' estremità del genoma virale. Introdurre un promotore SP6 immediatamente a monte all'estremità 5 'del genoma virale mediante overlap extension PCR (Figura 1D, PBAC / F1 SP6). Amplifica due frammenti di DNA sovrapposti via il primo standard di PCR di PBAC / F1 con le due coppie di primer SP6F + SP6R (formato del prodotto, 173 bp) e F1F + F1R (prodotto sbadi, 676 bp), ciascuno in una reazione di 50 microlitri contenente 1 ml DNA stampo (~ 200 pg / ml), 10 microlitri 5 × tampone PCR, 2 ml 10 dNTPs mM, 2,5 microlitri ciascuno dei 10 micron avanti e reverse primer, 0.5 pl 2 U / mL DNA polimerasi, 68 e 31,5 ml dH 2 O. Eseguire la PCR utilizzando il seguente profilo bicicletta: 98 ° C per 30 sec, e 25 cicli di 98 ° C per 10 sec, 60 ° C per 30 sec e 72 ° C per 20 sec. Gel-purificare i due frammenti di DNA PCR-amplificato dopo aver eseguito ognuno dei due prodotti di PCR su un gel bassofondente punto di agarosio 1,5%, come descritto nel protocollo 3.2. Fondere le due frammenti di DNA gel purificato tramite la seconda fusione PCR utilizzando il primer esterno SP6F + F1R (formato del prodotto, 821 bp) in una reazione 100 microlitri compreso 1 ml ciascuno dei due frammenti di DNA purificati (~ 100 pg / ml), 20 microlitri 5 × tampone PCR, 4 pl 10 mM dNTP, 5 ml ciascuno dei 10 micron avanti e reverse primer, 1 ml2 polimerasi U / mL DNA, 68 e 63 ml dH 2 O. Utilizzare il seguente profilo termico ciclismo: 98 ° C per 30 sec, e 25 cicli di 98 ° C per 10 sec, 60 ° C per 30 sec e 72 ° C per 30 sec. Gel-purificare l'amplicone PCR fusa da un basso punto di fusione gel di agarosio 1% point, come descritto nel protocollo 3.2. Eseguire la procedura di clonazione in cinque fasi descritte nei protocolli 3,1-3,5 per legare il 760 bp Pac I- Bsi WI frammento di gel purificato fuso PCR amplicone con il 9532 bp Pac I- Bsi WI frammento di PBAC / F1 per generare PBAC / F1 SP6. Rimuovere il preesistente, interna sito Xba I al nucleotide 9131 con l'introduzione di una mutazione puntiforme silenzioso (A 9134 → T) tramite estensione sovrapposizione PCR (Figura 1D, PBAC / F3 KO). Amplifica due frammenti di DNA sovrapposti per il primo standard di PCR di PBAC / F3 con il due coppie di primer x1f + X1R(formato del prodotto, 746 bp) e x2F + X2R (formato del prodotto, 316 bp) in una reazione di 50 microlitri nelle condizioni sperimentali descritte nel protocollo 4.1.1.1. Gel-purificare i due frammenti di DNA PCR-amplificate dopo la separazione elettroforetica su 1,5% gel a basso punto di fusione agarosio, come descritto nel protocollo 3.2. Fondere le due frammenti di DNA gel purificato tramite la seconda fusione PCR utilizzando i primers ultraperiferiche x1f + X2R (formato del prodotto, 1033 bp) in una reazione 100 microlitri nelle condizioni sperimentali descritte nel protocollo 4.1.1.3. Gel-purificare della PCR fuso da un basso punto di fusione gel di punto di agarosio 1%, come indicato nel protocollo 3.2. Eseguire la procedura di clonazione in cinque fasi descritte nei protocolli 3.1-3.5 per legare il 949 bp Avr II- Non ho frammento di gel purificato fuso PCR amplicone con il 16245-BP non I- Bsi WI e 2141-bp Bsi W I – frammenti Avr II di PBAC / F3 per produrre PBAC / F3 KO. </ li> Ingegnere una nuova Xba artificiale I sito deflusso a valle della fine del 3 'del genoma virale dalla società PCR mutagenesi sito-diretta (Figura 1D, PBAC / F4 RO). Generare un frammento di DNA mediante PCR di PBAC / F4 con primer ROF + ROR (formato del prodotto, 324 bp) in una reazione 100 ml contenenti 1 ml DNA stampo (~ 200 pg / mL), 20 microlitri 5 × tampone PCR, 4 ml 10 dNTPs mM, 5 ml ciascuno di 10 micron in avanti e indietro primer, 1 ml 2 U / ml DNA polimerasi, 68 e 64 ml dH 2 O. Eseguire la PCR utilizzando il seguente profilo bicicletta: 98 ° C per 30 sec, e 25 cicli di 98 ° C per 10 sec, 60 ° C per 30 sec e 72 ° C per 15 sec. Gel-purificare il frammento di DNA PCR-amplificato da un basso punto di fusione gel di punto di agarosio 1%, come indicato nel protocollo 3.2. Eseguire la procedura di clonazione in cinque fasi descritte nei protocolli 3,1-3,5 per legare il 283 bp Sfi I-Not Io frammento di gel purificato dell'amplicone PCR con il 16933 bp Sfi I- Non ho frammento di PBAC / F4 per creare PBAC / F4 RO. Assemblare una serie di quattro modificato, cDNA sovrapposte in un unico full-length SA 14 -14-2 BAC (PBAC / SA 14 -14-2) unendo a tre siti di restrizione naturale (BSR GI, Bam HI, e Ava io ) in modo sequenziale utilizzando cinque fasi clonazione procedure descritte nei protocolli 3.1-3.5 (Figura 1E): F1 SP6 → F1 F2 SP6 (sostituendo BSR G I- Not I frammento PBAC / F1 SP6 con quella PBAC / F2) → F1 SP6 F2F3 KO (sostituendo il Bam H I- Not I frammento PBAC / F1 F2 SP6 con quella PBAC / F3 KO) → F1 SP6 F2F3 KO F4 RO (sostituendo il Ava I-Not I frammento PBAC / F1 F2 SP6F3 KO con quella di PBAC / F4 RO). 5. Preparare una elevata purezza Maxi-prep del Full-length SA 14 -14-2 BAC Crescere una singola colonia di E. coli DH10B portando PBAC / SA 14 -14-2 a 3 ml di brodo 2xYT contenente 10 mg / ml Cml per 10 ore a 35 ° C con agitazione a 225-250 giri al minuto, e poi scalare inoculando 500 ml di 10 ore coltura batterica in 500 ml di 2xYT-Cml medie e coltivando l'inoculo per 6 ore a 35 ° C con agitazione vigorosa. Centrifugare la coltura batterica in due bottiglie da 250 ml a 3.107 xg per 15 min a 4 ° C. Risospendere ogni pellet in 30 ml di soluzione GTE (glucosio 50 mM, 25 mM Tris-Cl, e EDTA 10 mM [pH 8,0]), e quindi aggiungere 500 ml di 60 mg / ml di lisozima. Incubare le due sospensioni di cellule in ghiaccio per 10 minuti. Aggiungere 60 ml di soluzione Lysis appena fatto (0,2 N NaOH e 1% SDS) a ciascuna sospensione cellulare, mescolare bene fino a non toccare, e tenere i lisatia temperatura ambiente per 10 min. Aggiungere 45 ml di soluzione di neutralizzazione (100 ml, composto da 60 ml 5 M di acetato di potassio, 11,5 ml di acido acetico glaciale, e 28,5 ml di dH 2 O) per ogni bottiglia, mescolare accuratamente invertendo le bottiglie, e incubare lisati neutralizzate sul ghiaccio per 10 min. Centrifuga lisati neutralizzati a 18.566 × g per 20 minuti a 4 ° C. Trasferire il surnatante di entrambe le bottiglie in due nuove bottiglie da 250 ml; aggiungere 0,6 volume di 100% isopropanolo a ciascuno, e tenerli in ghiaccio per 20 min. Spin down precipitati a 18.566 g per 20 minuti a 4 ° C. Sciogliere ogni pellet in 5 ml di tampone TE, combinarli in un tubo da 50 ml (10 ml in totale), e precipitare l'RNA aggiungendo un volume uguale di 5 M cloruro di litio. Incubare la miscela in ghiaccio per 10 min. Centrifugare il precipitato di RNA a 14.636 xg per 20 min a 4 ° C. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 250 ml con il precipitato DNA aggiungendo 2 volumi di 100% di isopropanolo.Incubare la miscela in ghiaccio per 20 min. Spin down del precipitato DNA a 18.566 g per 20 minuti a 4 ° C. Aspirare il surnatante, risospendere il pellet di DNA in 9,5 ml di tampone TE (pH 7,6), e aggiungere 10 g di cloruro di cesio (CsCl) e 390 ml di 10 mg / ml EtBr. Caricare la soluzione di DNA-CsCl-EtBr in un tubo di polipropilene 16 x 76 mm sigillabile utilizzando una siringa dotata di un ago 18 G. Spin il gradiente di CsCl sigillato in un'ultracentrifuga a 401.700 xg per 16 ore a 20 ° C (Figura 3). Raccogliere una banda di DNA plasmidico BAC dal gradiente di CsCl utilizzando un ago da 18 G per creare una presa d'aria nella parte superiore del gradiente e una siringa da 20 G ago attrezzato per recuperare il DNA BAC dal lato del gradiente. Aggiungere 2,5 volumi di dH 2 O-butanolo saturo per il campione di DNA BAC EtBr-macchiato e mescolare nel vortex. Centrifugare la miscela a 13.400 xg per 1 min e Trasferire la fase acquosa inferiore per un nuovo 1,7 ml microtube. Ripetere questa procedura per sei volte. Precipitare il DNA BAC EtBr-aggiungendo 1/10 volume di 3 M acetato di sodio e 2,5 volumi di etanolo 100% al DNA BAC butanolo estratti e incubando per 10 min in ghiaccio. Centrifugare precipitato a 13.400 g per 10 min, lavare il pellet di DNA con 1 ml di etanolo al 70%, e ri-pellet che per centrifugazione. Far asciugare il pellet di DNA per 10 minuti e si dissolvono in 200 ml di tampone TE (pH 7,6). Nota: La figura 4 mostra una panoramica del sistema di genetica inversa per ICE SA 14 -14-2. 6. Trascrivere RNA sintetici in vitro da un full-length DNA ICE BAC linearizzato Eseguire un grande enzimi di restrizione di PBAC / SA 14 -14-2 con Xba I in un volume totale di 100 microlitri (contenente 3 mg DNA, 60 U dell'enzima, 1 × tampone di digestione, e 1 × BSA) a 37 ° C per 12-15 ore. Esaminare un'aliquota 3 ml del dreazione igestion su un gel di agarosio 0,8% contenente 0,5 mg / ml EtBr. Incubare la reazione di digestione ulteriormente con 25 U di mung bean nucleasi (MBN) a 30 ° C per 2 ore (Figura 4A). Portare il volume del campione della MBN trattati Xba I-digerito fino a 300 ml con dH 2 O. Aggiungere un volume uguale di fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (25: 24: 1) al campione diluito, vortex vigorosamente per 1 min, centrifugare a 13.400 g per 10 min, e poi trasferire la fase acquosa superiore ad un nuovo 1,7 ml provetta. Aggiungere un uguale volume di cloroformio e ripetere la procedura di estrazione. Recupero fenolo / cloroformio estratto, BAC linearizzato per precipitazione in etanolo: Aggiungere 1/10 volume di 3 M acetato di sodio e 2,5 volumi di etanolo al 100%, e incubare in ghiaccio per 20 min. Centrifugare precipitato a 13.400 g per 10 min, lavare il pellet di DNA con 1 ml di etanolo al 70%, e poi girare ridurla ricentrifugazione. Aria asciugare la pelle del DNAt per 10 minuti e scioglierlo in 30 ml di dH 2 O. Esaminate un'aliquota 1 microlitri della BAC recuperato su un gel di agarosio 0,8% con 0,5 mg / ml EtBr (Figura 5A). Eseguire una trascrizione run-off del DNA linearizzato BAC in un volume totale di 25 microlitri (contenenti ~ 200 ng DNA stampo, 0,8 mm berretto analogico [m 7 G (5 ') ppp (5') A], 1 rNTPs mM, 40 U RNasi inibitore, 20 U SP6 RNA polimerasi, 72 e 1 × tampone trascrizione) a 37 ° C per 1 ora (Figura 4B). Include 0,5 mM [3 H] UTP per RNA quantificazione sulla base di [3 H] UTP incorporazione, come monitorato mediante adsorbimento su carta DE-81 filtro. 69 Eseguire un un'aliquota 1-2 microlitri della reazione di trascrizione ballottaggio su un gel di agarosio 0,6% contenente 0,5 mg / ml di EtBr (Figura 5B). 7. Determinare RNA Infettività e Virus Yield Coltivare cellule BHK-21 a 150 millimetri culture piatti con una densità di 3 x 10 6 cellule / piatto per 24 ore a 37 ° C con 5% di CO 2. Nota: Mantenere le cellule BHK-21 in alfa mezzo essenziale minimo integrato con 10% di siero fetale bovino, glutammina 2 mM, vitamine, e la penicillina / streptomicina. Sciacquare il monostrato cellulare con 10 ml di soluzione fredda A (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8,1 mm Na 2 HPO 4, e 1,5 mm KH 2 PO 4). Staccare le cellule dalle stoviglie mediante trattamento con 4 ml di tripsina-EDTA (0,25%), e alla loro raccolta per centrifugazione a 270 xg in una centrifuga desktop per 2 min. Risospendere il pellet di cellule con 50 ml di soluzione fredda A in un tubo da 50 ml e centrifugare la sospensione cellulare a 270 xg per 2 minuti. Ripetere questa procedura di lavaggio per tre volte; Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere il pellet di cellule ad una densità di 2 x 10 7 cellule / ml in Sol A. Mescolare un'aliquota di 400 ml di sospensione cellulare con 2 μg di RNA sintetico in una cuvetta gap 2 mm, e prontamente elettroporazione la miscela con un elettroporatore in condizioni ottimali di elettroporazione: lunghezza 980 V, 99 msec impulsi, e 5 impulsi (Figura 4C). Nota: utilizzare il 3 H-marcato RNA sintetizzato nel protocollo 6.5 direttamente per l'elettroporazione, senza ulteriore purificazione. Lasciare le cellule elettroporate a temperatura ambiente per 10 minuti e trasferire in una provetta 1,7 ml contenente 600 ml di terreno di coltura completo. Preparare una diluizione seriale di 10 volte delle cellule elettroporate in 1 ml di mezzo di coltura completo e piastra un'aliquota di 100 microlitri di ogni diluizione sui monostrati di unelectroporated cellule BHK-21 (5 x 10 5) in una piastra da 6 pozzetti. Dopo 4-6 ore di incubazione, sovrapporre le cellule con 0,5% di agarosio in mezzo essenziale minimo contenente siero bovino fetale 10%. Incubare le piastre per 4 giorni a 37 ° C con 5% di CO 2. Visualizza il centro infettivas (placche) di fissaggio con il 7% di formaldeide e colorazione con 1% di cristallo viola a 5% di etanolo 27 (figura 6A). Opzionale: Esaminate le cellule RNA-elettroporate a 18-20 ore dopo la trasfezione per ICE espressione della proteina mediante saggi di immunofluorescenza 27,73 (Figura 6B), e raccogliere il surnatante dalle cellule RNA-elettroporate a 22 e 40 ore dopo la trasfezione per il virus titolazione saggi placca 27,63 (Figura 6C).