Singola molecola microscopia a fluorescenza su Planar bilayers supportati
Summary
Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.
Abstract
In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.
Introduction
La comprensione dei meccanismi attraverso i quali le proteine di membrana adempiono la loro funzione cellulare spesso può essere un compito impegnativo, perché le loro modalità d'azione sono spesso definiti da interazioni a bassa affinità, che sono difficili da individuare e valutare da metodologie biochimiche convenzionali. Le proteine di membrana potranno essere altamente arricchito in domini di membrana specifici 5,6 o formare strutture di ordine superiore dinamiche, che possono in linea di principio alterare la loro attività biologica 7.
Non invasiva laser assistita singola molecola fluorescenza microscopia è così diventata la metodologia di scelta per studiare il comportamento delle proteine cellulari in ambienti complessi. Questo vale in particolare per i processi biochimici che avvengono a livello della membrana plasmatica, in quanto questi possono in linea di principio essere monitorati in modalità rumore ridotto Total Internal Reflection (TIRF). Qui illuminazione campione è limitata a un massimo di 200 nm fetta sottile in prossimità di un vetro surface, che si traduce in una significativa perdita sfondo cellulare e, a causa delle caratteristiche della luce di eccitazione evanescente, anche in un notevole aumento della fluorescenza dell'intensità del segnale 8,9. Entrambi gli aspetti sono importanti quando si mira per alta risoluzione posizionale e temporale nella rilevazione singola molecola.
Planar SLB non sono compatibili solo con il microscopio TIRF. Quando funzionalizzati con ligandi opportuni ma anche fornire un accesso diretto allo studio delle dinamiche molecolari di riconoscimento cellula-cellula che si verificano nelle cellule immunitarie o altre cellule. Possono anche essere utilizzati semplicemente per posizionare cellule mobili e altrimenti non aderenti abbastanza vicino al vetrino in modo che tali cellule possono essere esposte in TIRF illuminazione, che è altamente desiderabile quando esperimenti di conduzione coinvolgono inseguimento molecola singola o singola SuperResolution basato molecola. A tal fine le proteine devono essere caricati su un SLB altamente mobile. Un vantaggio intrinseco della li utilizzati pid sono che non c'è legame non specifico di proteine affatto. Inoltre, SLB possono essere considerati come liquidi bidimensionali con una capacità intrinseca di guarire se stessi; illeciti di supporto di vetro vengono compensate fino ad un certo grado. Un protocollo passo-passo è prevista per generare bistrati altamente mobili cariche di proteine di interesse. La formazione di SLB planari è descritto, contenenti 1-palmitoil-2-oleoyl-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC) come ingrediente principale (90-99%) e sintetici e funzionalizzata lipidi 1,2-dioleoyl- sn -glycero-3 – {[N (5-ammino-1-carbossipentil) iminodiacetico acido] succinil} nichel sale (DGS NTA-Ni) in condizioni di scarsa abbondanza (1-10%). POPC trasporta un acido grasso saturo e un acido grasso monoinsaturo e forma doppi strati lipidici di alta fluidità anche a temperatura ambiente. DGS NTA-Ni lega con la sua headgroup di coda poli-istidina e serve come ancoraggio per le proteine poli-istidina-tag di scelta (Figura 1).
"> È importante sottolineare che l'hardware microscopio deve includere un numero di periferiche che sono descritte di seguito. Con le informazioni fornite e alcune conoscenze di base nel campo dell'ottica e della fisica del laser, qualsiasi biologo dovrebbe essere in grado di costruire una sola configurazione di imaging molecola. Eccitazione del campione dovrebbe essere idealmente eseguita su un microscopio invertito in modalità Total Internal Reflection (TIRF) come questo regime riduce la luce spuria e sfondo eccessivo risultante diversamente da cellulare auto-fluorescenza 9. Per questo, uno speciale obiettivo TIRF-grado (vedi sotto) e l'illuminazione laser sono necessari. Alcuni esperimenti richiederanno tempi di illuminazione all'interno dei millisecondi e gestito in rapida successione. Per risparmiare tempo di illuminazione o per evitare sbiancamento inutili causate dall'illuminazione ripetitiva è spesso utile per dividere la luce emessa in due o più canali spettrali. Questo permette la lettura simultanea di due o più profili di emissione, che può diventare un fattore significativo quando conducEsperimenti ting coinvolgono trasferimento Förster Resonance Energy (FRET). Qui l'emissione risultante dal singolo impulso luce di eccitazione può essere registrato sia dal donatore FRET e FRET accettore (come emissioni sensibilizzati). La fotocamera dovrebbe catturare abbastanza fotoni con sufficientemente basso sfondo di visualizzare singoli fluorofori durante il tempo di illuminazione. Software dovrà essere all'altezza del compito di sincronizzare eccitazione chiusura e l'acquisizione delle immagini. Una panoramica completa è riportata qui sotto e nella figura 2:Obiettivo TIRF-grado: Per illuminazione basata su obiettivi TIRF l'apertura numerica (NA) dell'obiettivo deve essere uguale o superiore a 1,4 utilizzando vetrini normali (n = 1.515) 9. Ingrandimento può variare tra 60x a 150 volte. L'obiettivo dovrebbe essere cromaticamente corretto per consentire parafocalità quando l'imaging differenti fluorofori.
Laser: Il numero dei disponibili laseOpzioni r è notevolmente aumentata negli ultimi anni. I moderni modulabili elettronicamente laser a onda continua a diodi sono economicamente efficienti e possono essere utilizzati con frequenza e velocità senza precedenti. Più costoso laser ioni gas eccellere in qualità del fascio laser, ma richiedono chiusura esterna (vedi sotto) e spesso esteso (acqua) di raffreddamento.
Persiane Eccitazione: modulatori acusto-ottico (AOM) consentono veloce chiusura in rapida successione 10. Per stretto chiudendo la combinazione di un AOM con persiane meccanici è raccomandato. In questo modo forte surriscaldamento della OMA dovuto all'esposizione luce continua è evitata e la luce fuoriesce dal AOM in bassa posizione viene annullato.
Le lenti vengono usati per allargare raggi laser e di concentrarsi loro sul piano focale posteriore dell'obiettivo. In questo modo, la luce di eccitazione lascia l'obiettivo come un fascio parallelo (figura 3), che è richiesto per l'illuminazione di TIRFil campione. Spostando il punto focale sul piano focale posteriore dal centro alla periferia del obiettivo cambierà l'angolo al quale il fascio lascia l'obiettivo, ma non la posizione del punto laser al campione (figura 3), che è una funzione della geometria complessiva del fascio. Illuminazione TIRF consegue ad un angolo critico, che può essere regolata tramite una serie di specchi che funzionano come un periscopio per tradurre il punto focale del laser nel piano focale dell'obiettivo. Lenti devono essere cromaticamente corrette e possono essere utilizzati in un insieme di due o tre lenti. Un sistema a tre lenti costituito da due lenti agiscono come un telescopio per allargare il fascio laser (e quindi il punto di illuminazione al campione) e una terza lente per focalizzare il fascio allargato nel piano focale posteriore dell'obiettivo (Figura 4). Entrambe le funzioni (telescopio e focalizzazione) possono essere ottenuti anche con una combinazione di soli due lenti (vedere Figura 4).
<p class="jove_content"> Specchi dovrebbe essere almeno il 95% di riflessione per evitare la perdita di luce laser. Per ogni regolazione fascio un insieme di due specchi viene solitamente applicato come tale disposizione è sufficiente regolare precisamente ogni angolo e la posizione di un fascio laser.Sovrapposizioni dicroici riflettono e trasmettono la luce di diverse lunghezze d'onda determinate e sono utilizzati per sovrapporre o dividere i fasci di due laser.
Filtri Polychroic sono più complessi di filtri dicroici e sono necessari per riflettere la luce di eccitazione in ingresso e in uscita trasmettere emissione di luce dal campione. Essi sono posti nel cubo filtro tra l'obiettivo e la lente tubo del microscopio.
Pulire filtri: A seconda del tipo di laser employe d laser pulire filtri con una banda stretta di trasmissione deve essere collocato nel raggio laser destra dopo che lascia il laser.
Filtri notchsono progettati per assorbire efficacemente la luce laser con una larghezza di banda stretta e trasmettere ogni altra luce. Essi sono posti all'interno del percorso di emissione per filtrare qualsiasi luce eccitazione laser spuria. Tuttavia, i filtri notch funzionano solo a 0 ° angolo di entrata. Se la larghezza di banda del filtro notch è molto forte, i diversi angoli in arrivo non possono essere riflessi più. Blocco di luce laser laser collimato non è interessato, ma la luce di back-sparsi potrebbe non essere efficiente impedito di raggiungere la fotocamera.
Ruote portafiltri motorizzate dotati di filtri appropriati ruote possono essere facilmente inseriti nel eccitazione ed emissione percorso e permettono un semplice passaggio tra le diverse intensità di luce (se dotato di filtri ND) o canali fluorescenti (quando posto di fronte a una lampada allo xeno o di mercurio per raziometrico Calcio Imaging o davanti alla telecamera per selezionare per il fluoroforo che emette).
50:50 cubo beam splitter cun utilizzato per dividere in due fasci laser percorsi ottici distinti eccitazione e anche di combinarli davanti periscopio.
Separatore di fascio (percorso di emissione): Per una rapida acquisizione immagine senza necessità di modifiche filtri fisici, il fascio di emissione è suddiviso in un canale blu spostata e spostata verso il rosso. In linea di principio, divisori di fascio può essere costruito impiegando un cuneo dicroico o un insieme di specchi e di uno specchio dicroico per separare il fascio di emissione in un modo dipendente dalla lunghezza d'onda. Due filtri di emissione sono necessari per ripulire i canali emessi.
Filtro spaziale: il filtraggio spaziale del fascio di eccitazione a volte è necessario per rimuovere i raggi di luce non parallele emesse da raggi laser di bassa qualità. Un filtro spaziale costituito da un telescopio a due lenti con un piccolo foro stenopeico collocato esattamente nel punto focale di entrambi gli obiettivi. Questa luce spuria modo risultante da porzioni non paralleli del raggio laser viene efficacemente bloccata. Sucondizioni ch devono essere soddisfatte al momento di stabilire la microscopia a base di TIRF. Aumenta filtraggio spaziale con fori più piccoli, che sono più difficili da posizionare nel punto focale, e con lunghezze focali minori della prima lente. Per ridurre gli effetti causati da aberrazioni è vantaggioso impiegare al posto delle lenti semplici di alta qualità e obiettivi del microscopio Infinity corretta con basso ingrandimento (10x o 20x).
Periscope: Una configurazione periscopio è necessario tradurre il fascio laser focalizzato sul piano focale posteriore dell'obiettivo, un prerequisito per l'imaging TIRF. Può essere facilmente costruito da due specchi due pollici, una fase traslazionale per la regolazione del primo specchio ed un posto per posizionare il secondo specchio per riflettere il fascio luminoso focalizzato allargata e di eccitazione nel microscopio (Figura 5).
Fotocamera: retroilluminato Electron-Moltiplicando Charge Coupled Devices (EMCCD) sono comunemente usate perla registrazione di segnali di singola molecola. Questo è a causa della loro elevata efficienza quantica (fino al 95%), ad alta velocità di acquisizione (fino a 30 MHz) e relativamente a basso rumore. Raffreddamento fino a -80 ° C riduce il rumore termico ed è supportato da una serie di telecamere EMCCD attualmente disponibili. Una limitazione della tecnologia EMCCD è che il rumore fotocamera aumenta linearmente con il sia il guadagno della telecamera e il segnale che viene catturato. Questo non è il caso con scientifici CMOS (sCMOS) telecamere, che sono significativamente meno costosi e operano grazie alla particolare architettura del chip sCMOS anche molto più veloce di telecamere EMCCD. Tuttavia un problema associato con la tecnologia CMOS è che l'acquisizione immagine presenta ancora un certo grado di un'indicazione quantitativa su un unico livello molecola, perché ogni pixel dotato sensibilità di rilevamento diverso. In linea di principio può essere compensata tramite pixel normalizzazione, ma questa procedura non è affatto banali 11. Questo è il motivo per cui abbiamo ancora esitato a rielogiare telecamere sCMOS per singolo microscopio molecola, ma in vista del rapido sviluppo di questa tecnologia, le macchine fotografiche sCMOS potrebbero presto diventare la fotocamera di scelta. Lento telecamere telecamere CCD a scansione evitare l'amplificazione legati rumore e pixel varianza tutti insieme e sostenere più veloci velocità di acquisizione se possono essere utilizzati in una cosiddetta modalità 'cinetica'. In questo modo l'intero chip fotocamera eccezione di una regione di interesse (ROI) è mascherato, che rende possibile impiegare chip stesso come dispositivo di memorizzazione. Dopo la ROI viene esposta per la prima volta, i costi risultanti sono spostati nell'area mascherata della linea di chip pixel per riga di pixel, in cui l'immagine è protetta da un'ulteriore esposizione alla luce. Una volta che lo spostamento di tutte le linee della ROI nella regione mascherato è completata (nel range sub-millisecondo), il ROI stessa è pronta per l'esposizione successiva. Questo ciclo viene ripetuto fino a quando tutte le linee di pixel del CCD pagano. Il chip viene poi letta lentamente con marcatamente redurumore di lettura ced. Ad esempio su un chip 1000 x 1300 pixel, 20 ROI di 50×50 pixel possono essere registrati in rapida successione. Poiché le immagini rimangono sul chip per un tempo considerevole prima di essere letta, è fondamentale garantire mascheramento di alta qualità e per raffreddare la telecamera (ad esempio con azoto liquido) come mezzo per ridurre il rumore termico eccessivo. Alcune videocamere EMCCD supportano anche la modalità cinetica.
Software: Timing dei laser, persiane, AOMS e di esposizione della fotocamera, così come la memorizzazione delle immagini corretto sono parte integrante di qualsiasi esperimento di imaging di successo. In linea di principio molte operazioni definite possono essere programmati con i pacchetti software disponibili che vengono con la macchina fotografica. Pacchetti software commerciali supportano un gran numero di periferiche hardware, che possono essere attuate con scarso know-how tecnico.
Generatore di impulsi, di acquisizione dati (DAQ) (con canali di uscita analogici e digitali) e oscilloscopio: Un generatore di impulsi è unscelta eccellente per convertire impulsi di comando in impulsi di tempo e di tensione definita. In questo modo i laser possono essere controllati con precisione per la potenza di uscita e cronometrate in millisecondi per gamma sub-millisecondi. Schede DAQ con uscite analogiche a raggiungere lo stesso e sono facilmente integrabili nella scheda madre del computer tramite slot PCI. Durata impulso, ampiezza e frequenza vengono verificati con un oscilloscopio.
Allegato dell'intero percorso del fascio di eccitazione: Per evitare fluttuazioni nel profilo di eccitazione a causa convezioni aria l'intero percorso del fascio di eccitazione deve essere racchiuso dal suo ambiente di laboratorio. Questa misura è particolarmente importante per lo svolgimento di microscopia TIRF. Componenti ottici sono protetti da polvere e l'occhio umano dall'esposizione luce laser. Le custodie possono essere facilmente costruire da cartone nero, che possono essere acquistati nei negozi di arti.
Per determinare la fluidità del Recovery SLB fluorescenza dopo PhotobleacHing (FRAP) misurazioni 12 vengono eseguiti. Per FRAP l'esistenza di due percorsi ottici eccitazione è consigliabile (vedere Figura 3). Il primo percorso ottico è progettato per l'immagine di fluorescenza del doppio strato. Questo può essere fatto in configurazione TIRF e con bassa intensità luminosa. Il secondo percorso ottico dovrebbe consentire un breve ma intenso impulso candeggina e deve essere configurato in modo non TIRF, in modo che lasci l'obiettivo lungo l'asse ottico. Una apertura rotonda può essere inserito nel percorso del fascio di eccitazione (vedi Figura 8) per proiettare un profilo di candeggina perfettamente rotonda con bordi definiti. Per questa immagine apertura sul piano oggetto, la sua posizione ottimale sia nel piano focale della lente 3 (vedi Figura 3). Tuttavia, a causa della lunghezza focale di questa lente, un'immagine un'apertura di qualità sufficiente può anche essere generato, quando l'apertura è posto in posizioni leggermente spostata.
Dopo aver eseguito tegli l'imaging esperimento i dati grezzi devono essere analizzati in modo appropriato. Diversi protocolli passo-passo sono offerti, che coprono la regolazione delle impostazioni principali (ad esempio potenza di illuminazione e di tempo, angolo TIRF), l'acquisizione e l'analisi dei dati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microscopia molecola singola offre l'opportunità unica di studiare il comportamento delle proteine all'interno del loro ambiente cellulare nativo. L'imaging molecolare diventa quindi sempre più attraente per una vasta comunità scientifica, ma molti scienziati di vita ancora evitano l'investimento iniziale in tecnologia e know-how. Il principale vantaggio derivante dall'assemblaggio di un proprio sistema di imaging è che può essere facilmente adattato alle esigenze specifiche di chiunque.
Come suggerito qui un non TIRF-fascio di eccitazione può essere facilmente implementato in oltre ad un percorso di luce TIRF esistente, Se si desidera una rapida e definita fotometabolismo (o -Attivazione) di fluorofori e leganti, ad esempio quando si esegue FRAP o ligando esperimenti uncaging 14 . L'introduzione di un divisore di fascio di emissione consente la registrazione simultanea di almeno due e, in alcuni casi fino a quattro canali fluorescenti. L'elenco delle estensioni è essenzialmente limitata solo dallala propria immaginazione.
Ad esempio, l'attuazione di una ruota portafiltri motorizzata emissione nel percorso di emissione consente la commutazione rapida tra un massimo di dieci canali fluorescenti differenti. Quando si combinano due ruote portafiltri emissione motorizzate (tutte dotate di asole 10 filtro) in serie, fino a 18 canali fluorescenti può essere letto. L'imaging basato TIRF-può essere completata con misure di mobilitazione calcio e interferenze Riflessione Microscopia (IRM), dopo l'integrazione di un percorso lampada allo xeno di eccitazione o Mercurio. IRM è il metodo di scelta per visualizzare il grado in cui le cellule sono attaccate alla superficie di vetro o un SLB e possono quindi fornire informazioni critiche per l'interpretazione di dati di immagini basato TIRF-. Stabilire un fascio di eccitazione allargata con l'uso di un semplice specchio dicroico e un laser supplementare di 405 nm permette conduzione microscopia localizzazione fotoattivazione (PALM) o stocastico microscopia ottica ricostruzione (STORM), vale a dire due superresolutmetodologie di ioni con una precisione di posizionamento al di sotto del limite di diffrazione di luce visibile 15,16.
Tuttavia, il successo sperimentale non è solo una questione di hardware. Per trarre il massimo vantaggio di imaging basato TIRF-rumore ridotto, cellule devono entrare in contatto su una superficie in un modo che non impone vincoli sulla superficie cellulare o che interferisce con la fisiologia della loro membrana plasmatica. SLB funzionalizzato con le proteine appropriate per l'adesione cellulare stanno superando adatto per questo scopo, perché tutti i ligandi SLB-incorporati sono lateralmente mobili e regolare la loro posizione laterale all'interno del doppio strato in risposta i recettori della dinamica vincolanti e segregazione.
Per produrre SLB in maniera riproducibile, è meglio iniziare con i SUV di elevata purezza. Come descritto qui, è quindi essenziale per rimuovere vescicole multilamellari, anch'essi prodotti durante sonicazione, in due fasi ultracentrifugazione come questi interfere con la formazione di SLB contigui caratterizzati elevata fluidità. SLB di modulo di alta qualità solo su superfici di vetro puliti. Una volta vetrini puliti dovrebbero essere utilizzate immediatamente o conservate nel vuoto. È importante sottolineare che, SLB non devono mai essere esposte all'aria come questo avrebbe portato alla loro distruzione. SLB lavaggio comporta, come mostrato, buffer di risciacquo con l'uso di una pipetta sierologica, poiché questo non è solo una procedura di salvataggio ma anche risparmio di tempo.
Durante la raccolta e la purificazione di proteine SLB residenti dovrebbe essere evitato l'uso di detergenti. Questo perché il detersivo ridurrà in modo significativo la mobilità di proteine, anche se presenti in tracce. Per aggirare la necessità di detersivo tutti insieme, espressione solubile di polyhistidine secreta ligandi tag attrezzato è raccomandato in cellule di mammifero o di insetti. Se ripiegamento da corpi di inclusione di E.coli è necessaria, la cautela deve essere applicato per rimuovere detergenti efficacemente dai corpi di inclusione prima della loro disoccupazione e ripiegamento.
Un importante vantaggio di impiegare SLBS deriva dalla loro natura modulare e di ricostituzione, che permette di sezionare specificamente il ruolo di un dato recettore-ligando per l'attivazione delle cellule e l'adesione cellulare. A questo proposito è importante ricordare che DGS NTA-Ni dovrebbe essere presente al 10% entro il SLB, al fine di evitare che le proteine in competizione per i siti di legame NTA-NI. Quando si impiegano SLB ospitano solo l'1% o 2% DGS NTA-Ni, una riduzione della associazione dei una specie di proteine polyhistidine-tag si può notare, soprattutto quando co-incubazione quantità crescenti di una seconda specie di proteine polyhistidine-tagged (inedito osservazione). Questo fenomeno non si osserva quando si lavora con SLB che caratterizzano il 10% DGS NTA-Ni.
Mentre non abbiamo mai osservato legame non specifico di qualsiasi proteina polyhistidine-tagged testato per SLB contenenti DGS NTA-Ni, tale possibilità dovrebbe essere messa alla prova quando l'introduzione di una proteina per la prima volta,A tal fine si consiglia l'uso di SLB privi di DGS NTA-Ni (la proteina non dovrebbe vincolare). In secondo luogo, quando si utilizza un SLB contenente DGS NTA-Ni, la proteina dovrebbe venire fuori completamente dopo il lavaggio del SLB con PBS contenente imidazolo 300 mm.
Un altro vantaggio significativo di impiegare SLB è che le interazioni transitori e gli eventi di segnalazione possono essere monitorati con una maggiore risoluzione spazio-temporale 17-19. Questo è almeno in parte perché un processo vincolante tridimensionale è sostanzialmente ridotto a due dimensioni di imaging, soprattutto durante la registrazione in modalità TIRF rumore attenuato. L'uso di SLB è compatibile con rilevazione del segnale singola molecola, un prerequisito per la foto-attivati localizzazione microscopia (PALM) o stocastico microscopia ottica ricostruzione (STORM), ovvero la microscopia SuperResolution con una risoluzione al di sotto del limite di diffrazione 15,16. Queste modalità particolari di imaging consentono di singola molecola Förster Resonance Energy Traesperimenti nsfer progettati per visualizzare i singoli interazioni proteina-proteina in un ambiente sinaptica 20. Questo approccio è spiegato in modo molto dettagliato in una pubblicazione JoVE chiamato 21 "Misurare vincolante che utilizzava un test FRET-microscopia test TCR-pMHC".
Nell'interpretare esperimenti basati-SLB si dovrebbe sempre tenere a mente che non tutte le proprietà di una membrana plasmatica di una cellula vivente si caratterizzano per SLB, e che alcune delle qualità mancanti potrebbero influenzare la fisiologia sotto inchiesta. Dopo tutto, le proteine SLB-incorporati vengono liberamente diffondendo e non organizzati in microdomini di membrana come la maggior parte dei loro omologhi cellulari sono 5,6,22. Fogli membrana plasmatica immobilizzata derivate da cellule aderenti, che conservano l'architettura membrana plasmatica delle cellule viventi in una certa misura, sono stati impiegati con successo per studiare l'assorbimento da antigeni di membrana-embedded dai linfociti B 23. Tuttavia, anche talemembrane non interagiscono con un citoscheletro altamente dinamico e presentano alcuna flessibilità in quanto sono supportati da una superficie di vetro rigida. Alla luce di queste discrepanze vi è chiaramente la necessità di SLB ingegneria, che offrono i mezzi per compartimenti stagni proteine in modo definito e che sono supportati da superfici di flessibilità regolabile o da superfici che cambiano la loro rigidità in risposta agli impulsi luminosi applicati localmente.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MA è stato sostenuto da una borsa di studio di Schrödinger Fondo austriaco della scienza (FWF, J3086-B11) e ringrazia il Max-Planck-Società per il sostegno finanziario e amministrativo. GS è stato sostenuto dalla scienza e la tecnologia Fondo Vienna (WWTF, LS13-030). JH è stata sostenuta dalla scienza e la tecnologia Fondo Vienna (WWTF, LS14-031).
Materials
| #1.5 glass slides | VWR | 631-0853 | |
| 250ml round bottom flask | VWR | 201-1357 | |
| 50:50 beam splitter cubes | Thorlabs | BS013 | |
| Acousto-opitcal modulator C1205-2 | Isomet | – | only necessary if CW lasers, which cannot be modulated, are used |
| Alexa Fluor 488-NHS | Life technologies | A-20000 | |
| Alexa Fluor 555-NHS | Life technologies | A-20009 | |
| Alexa Fluor 647-NHS | Life technologies | A-20006 | |
| autoclave tape | VWR | 489-1312 | or any other heat-stable sticky tabe |
| Avanti Mini-Extruder | Avanti Lipids | 610000 | alternative to the bath sonicator |
| bath sonicator QSONICA Q700 | QSONICA | Q700 | |
| beam splitter | Cairn | P280/210/MLS | |
| Büchi rotary evaporator | VWR | 531-0837 | |
| camera | Andor | iXon Ultra 897 | see manuscript text for alternatives |
| concentarted hydrogenperoxide | Roth | 9683.1 | |
| concentrated sulfuric acid | Roth | X944.2 | |
| epoxy glue | Uhu | 45705 | Uhu plus sofortfest 2min |
| filter wheel | Sutter instruments | Lambda 10-2 | |
| LabTek chambers | VWR | 734-2062 | |
| laser | Toptica | – | different variants (wavelengths 375 – 785 nm) are available |
| lens | Thorlabs, Newport | – | |
| DGS NTA-Ni (lipid) | Avanti Lipids | 790404C | already in Choroform-solved delivered version of the nicekl salt variant is recommended |
| POPC (lipid) | Avanti Lipids | 850457C | already in Choroform-solved delivered version is recommended |
| microscope Zeiss Axiovert 200 | Zeiss | – | |
| mirrors | Thorlabs | BB1-E02 | |
| optical filters | AHF, Chroma, Semrock | – | filter sets are available for many different combinations of dyes |
| oscilloscope | BK Precision | 2120C | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Life technologies | 14190-136 | degas before usage |
| periscope | Thorlabs | RS99/M | |
| picodent twinsil 22 | Picodent | 13001000 | alternative to the epoxy glue |
| power meter Lasermate-Q | Coherent | – | any powermeter sensitive in the used spectral range will do |
| pulse generator | Stanford Research Systems | SRS DG535 | |
| spatial filter | Thorlabs | KT310/M | |
| syringe filter 0.2µm | Millipore | GVWP04700 | |
| TIRF-capable apochromat objective 100x, NA 1.46 | Zeiss | 440782-9800-000 | |
| trichloromethane/chloroform | Roth | 3313.1 | |
| tubes forultracentrifugation polycarbonate 1.00 mm, 11 mm x 32 mm | Thermo Fisher | 45237 | |
| Sorvall ultracentrifuge | Thermo Fisher | RC M150GX | |
| ultracentrifuge rotor | Thermo Fisher | S120-AT2 | |
| UV spectrophotometer Nanodrop 2000c | Thermo Fisher | – | |
| vacuum pump | VWR | 181-0248 |
Referências
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