Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.
In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.
Forståelse af de mekanismer, som membranproteiner opfylder deres cellulære funktion kan ofte være en udfordrende opgave, fordi deres virkemåder ofte defineres af lav affinitet interaktioner, som er vanskelige at påvise og vurdere ved konventionelle biokemiske metoder. Membranproteiner kan endvidere være stærkt beriget i specifikke membrandomæner 5,6 eller danner dynamiske strukturer af højere orden, som kan principielt ændrer deres biologiske aktivitet 7.
Ikke-invasiv laser-assisteret enkelt molekyle fluorescens mikroskopi er dermed blevet den metode valg til at studere protein adfærd i komplekse cellulære miljøer. Dette er især tilfældet for biokemiske processer, der foregår på plasmamembranen, da disse kan i princippet blive overvåget i støj-reduceret total intern refleksion (TIRF) tilstand. Her prøvebelysning er begrænset til en op til 200 nm-tynd skive i umiddelbar nærhed af et glas surface, hvilket resulterer i et betydeligt tab i cellulær baggrund og på grund af de særlige kendetegn ved den kortvarige excitationslys, også i en betydelig stigning i fluorescens signalintensitet 8,9. Begge dele er vigtige, når der sigtes efter høj positionelle og tidsmæssig opløsning i enkelt molekyle detektion.
Plane SLBs er ikke kun kompatibel med TIRF mikroskopi. Når funktionaliserede med passende ligander de giver også direkte adgang til at studere de molekylære dynamik celle-celle genkendelse som de forekommer i immunceller eller andre celler. De kan også simpelthen anvendes til at positionere bevægelige og ellers ikke-adhærente celler tæt nok på objektglasset, således at sådanne celler kan afbildes i TIRF belysning, hvilket er meget ønskeligt, når ledningsforstyrrelser forsøg med enkelt molekyle sporing eller enkelt molekyle-baserede superresolution. Med henblik herpå proteiner skal læsses på en meget mobil SLB. En iboende fordel ved den anvendte li PID'er er, at der ikke er nogen uspecifik binding af proteiner overhovedet. Desuden kan SLBs betragtes som todimensionale væsker med en iboende evne til at helbrede sig selv; uregelmæssigheder i understøtningen glas kompenseres op til en vis grad. En trin-for trin-protokollen er fastsat til at generere meget mobile dobbeltlag ladede med proteiner af interesse. Dannelsen af plane SLBs er beskrevet, som indeholder 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (POPC) som hovedingrediens (90-99%) og de syntetiske og funktionaliserede lipid 1,2-dioleoyl- sn-glycero-3 – {[N (5-amino-1-carboxypentyl) -iminodieddikesyre] succinyl} nikkel salt (DGS NTA-Ni) i lav tæthed (1-10%). POPC bærer en mættet fedtsyre og en mono-umættet fedtsyre og danner lipiddobbeltlag med høj fluiditet, selv ved stuetemperatur. DGS NTA-Ni binder med sin hovedgruppe til poly-histidin haler og tjener som anker for poly-histidin-mærkede proteiner af valg (figur 1).
"> Det er vigtigt, skal mikroskopi hardware omfatte en række eksterne enheder, som er beskrevet nedenfor. Med de oplysninger, og nogle grundlæggende viden i optik og laser fysik, bør enhver biolog kunne bygge et enkelt molekyle billeddannelse setup. Sample magnetisering bør ideelt set være udført på et inverteret mikroskop i total intern refleksion (TIRF) tilstand, da dette regime reducerer falsk lys og overdreven baggrund ved ellers af cellulær autofluorescens 9. Til dette en særlig TIRF-stand mål (se nedenfor) og laserbelysning er nødvendige. Nogle forsøg vil kræve belysning gange inden for millisekunder og drives i hurtig rækkefølge. For at spare belysningstiden eller for at undgå unødig blegning forårsaget af repetitive belysning er det ofte nyttigt at opdele det udsendte lys i to eller flere spektrale kanaler. Dette giver mulighed for samtidig udlæsning af to eller flere emissionsprofiler, som kan blive en væsentlig faktor, når conducTing forsøg med Förster Resonance Energy Transfer (FRET). Her emissionen som følge af enkelt excitationslys puls kan optages både fra FRET donor og FRET acceptor (som sensibiliserede emission). Kameraet skal fange nok fotoner med tilstrækkelig lav baggrund at visualisere enkelte fluoroforer løbet belysningen tid. Computer software vil være op til opgaven at synkronisere excitation lukke og billedoptagelse. En omfattende oversigt er givet nedenfor og i figur 2:TIRF-stand mål: Til objektiv-baserede TIRF belysning den numeriske apertur (NA) af målet skal være lig med eller større end 1,4 ved hjælp af standard objektglas (n = 1.515) 9. Forstørrelsen kan variere mellem 60x til 150x. Målet bør være kromatisk korrigeres for at muliggøre confocality når billeddannelse forskellige fluoroforer.
Lasere: Antallet af tilgængelige laser optioner er steget betydeligt i de seneste år. Moderne elektronisk modulerbar kontinuert bølge diode lasere er omkostningseffektive og kan betjenes med hidtil uset frekvens og hastighed. Dyrere gas ionlasere udmærke sig i laserstrålen kvalitet, men kræver ekstern lukke (se nedenfor) og ofte omfattende (vand-) afkøling.
Excitation skodder: akustisk-optiske modulatorer (AOM) giver hurtig lukke hurtigt efter hinanden 10. Anbefales til stram lukke kombinationen af en AOM med mekaniske skodder. På denne måde omfattende opvarmning af AOM grundet konstant lys eksponering undgås og lys lækker fra AOM i off-positionen er annulleret ud.
Linser bruges til at udvide laserstråler og koncentrere dem på bagsiden brændplan af målet. På denne måde excitationslyset forlader formål som en parallel stråle (figur 3), som er nødvendig for TIRF belysning afprøven. Flytning omdrejningspunktet i ryggen brændplan fra centrum til periferien af mål vil ændre den vinkel, hvor strålen forlader mål, men ikke placeringen af laserpunktet ved prøven (figur 3), som er en funktion af den samlede stråle geometri. TIRF belysning ensues på et kritisk vinkel, der kan justeres ved hjælp af et sæt spejle fungerer som et periskop at oversætte omdrejningspunktet for laseren inden brændplanet af målet. Linserne skal kromatisk korrigerede og kan anvendes i et sæt af to eller tre linser. En tre-linsesystem består af to linser, der fungerer som et teleskop at udvide laserstrålen (og dermed belysningen stedet på modellen) og en tredje linse til at fokusere den udvidede stråle ind i bagsiden brændplan af målet (figur 4). Begge funktioner (teleskop og fokusering) kan også opnås ved en kombination af kun to linser (se figur 4).
<p class="jove_content"> Spejle bør være mindst 95% reflekterende for at undgå tab af laserlys. For hver bjælke justering et sæt af to spejle anvendes sædvanligvis som sådan arrangement er tilstrækkelig til præcist at indstille enhver vinkel og position af en laserstråle.Dikroiske overlejringer reflektere og transmittere lys forskellige specificerede bølgelængder, og er vant til at overlejre eller splitte bjælker af to lasere.
Polychroic filtre er mere komplekse end dichroic filtre og der er behov for at reflektere indkommende excitationslys og transmittere spændende emission lys fra prøven. De er placeret i filteret terningen mellem objektiv og mikroskop rør linse.
Ryd op filtre: Afhængig af type laser employe d laser rense filtre med en smal transmissionsbåndbredde skal placeres ind i laserstrålen lige efter den forlader laseren.
Notchfiltreer designet til effektivt at absorbere laserlys med en smal båndbredde og transmittere alle andre lys. De er placeret inden emissionen vej at bortfiltrere enhver falske laser excitation lys. Men notch filtre fungerer kun ved 0 ° indgående vinkel. Hvis båndbredden af båndstopfilteret er meget skarp, kan de forskellige indkommende vinkler ikke afspejles mere. Blokering af kollimeret laser laserlys er ikke påvirket, men tilbagekastet lys muligvis ikke effektivt hindres i at nå kameraet.
Motoriserede filterhjul udstyret med passende filtre hjul let kan placeres i excitation og emission pathway og tillade simpel omskiftning mellem forskellige lysintensiteter (når udstyret med ND-filtre) eller fluorescerende kanaler (når det anbringes foran en xenon eller kviksølvbuelampe for ratiometrisk calcium billeddannelse eller foran kameraet til at vælge for at udsende fluorophor).
50:50 cube stråledeler cen bruges til at spalte laserstråler i to separate excitationsstrålen stier og også at kombinere dem foran periskop.
Stråledeler (emission sti): Til hurtig billedoptagelse uden behov for fysisk filter ændringer er udledningen strålen opdeles i et blåt forskudt og rødforskudt kanal. I princippet kan stråledelere bygges ved anvendelse af en dikroisk kile eller et sæt af spejle og et dikroisk spejl til at adskille emission bjælke i en bølgelængde-afhængig måde. To emissionsfiltre er nødvendige for at rense de udsendte kanaler.
Spatialfilteret: rumlig filtrering af excitationsstrålen kræves undertiden for at fjerne ikke-parallelle lysstråler, der udsendes fra lav kvalitet laserstråler. En rumlig filter består af et to-linse teleskop med en lille pinhole placeret præcis på omdrejningspunktet for begge linser. På denne måde falske lys som følge af manglende parallelle dele af laserstrålen bliver effektivt blokeret. Such betingelser skal være opfyldt, når oprettelse TIRF-baserede mikroskopi. Rumlige filtrering stiger med mindre porer, som er sværere at placere i det omdrejningspunkt, og med mindre brændvidder af den første linse. For at reducere virkninger forårsaget af linseaberrationer er det fordelagtigt at anvende i stedet for simple linser høj kvalitet og uendeligt korrigeret mikroskop mål med lav forstørrelse (10x 20x) eller.
Periscope: et periskop opsætning er nødvendigt at oversætte den fokuserede laserstråle i ryggen fokalplan af målet, en forudsætning for TIRF billeddannelse. Det kan let bygges af to to-tommers spejle, en translationel fase for at justere det første spejl og en stilling til at placere det andet spejl til at reflektere det udvidede og fokuseret excitationsstråle i mikroskopet (figur 5).
Kamera: Back-belyst Electron-Multiplying Charge Coupled Devices (EMCCD) anvendes rutinemæssigt tilregistrering af enkelt molekyle signaler. Dette er på grund af deres høje kvanteudbytte (op til 95%), høj erhvervelse hastighed (op til 30 MHz) og forholdsvis lav støj. Nedkøling til -80 ° C reducerer termisk støj og støttes af en række aktuelt tilgængelige EMCCD kameraer. En begrænsning af EMCCD teknologi er, at kameraet støj stiger lineært med både kameraet forstærkning og signalet blive fanget. Dette er ikke tilfældet med videnskabelige CMOS (sCMOS) kameraer, som er betydeligt billigere og opererer på grund af den særlige arkitektur sCMOS chippen også meget hurtigere end EMCCD kameraer. Men et problem forbundet med CMOS-teknologi er, at billedoptagelse mangler stadig en vis grad af en kvantitativ udlæsning på et enkelt molekyle niveau, fordi hver pixel har forskellige detekteringsfølsomhed. I princippet kan dette blive kompenseret gennem pixel normalisering, men denne procedure er på ingen måde trivielle 11. Det er derfor, vi stadig tøver med at rerose sCMOS kameraer til enkelt molekyle mikroskopi, men i betragtning af den hurtige udvikling af denne teknologi, kan sCMOS kameraer snart blive kameraet valg. Langsomme scan CCD-kameraer kameraer undgår forstærkning-relaterede støj og pixel varians alle sammen og støtte hurtigste erhvervelse satser, hvis de kan betjenes i en såkaldt 'kinetic' mode. I denne tilstand hele kamerachippen bortset fra et område af interesse (ROI) er maskeret, hvilket gør det muligt at anvende selve chippen som en lagringsenhed. Efter ROI udsættes for første gang, er de resulterende afgifter flyttet ind den maskerede område af chippen pixellinje pixel linje, hvor billedet er beskyttet mod yderligere udsættelse for lys. Når flytning af rør til ROI i den maskerede regionen er afsluttet (i sub-millisekunder), ROI selv er klar til næste eksponering. Denne cyklus gentages, indtil alle pixellinjer af CCD-chip bliver opkrævet. Chippen aflæses derefter langsomt ud med markant Reduced udlæsning støj. For eksempel på en 1000 x 1300 pixel chip, kan der optages 20 ROI'er af 50×50 pixel i hurtig rækkefølge. Fordi billederne forbliver på chippen i lang tid, før de udlæses, er det vigtigt at sikre høj kvalitet maskering og til nedkøling af kameraet (fx med flydende nitrogen) som et middel til at reducere overdreven termisk støj. Nogle EMCCD kameraer understøtter også den kinetiske tilstand.
Software: Timing af lasere, skodder, AOMS og kamera eksponering samt ordentlig billede opbevaring er en integreret enhver succesfuld billeddannelse eksperiment. I princippet kan programmeres mange definerede operationer med tilgængelige softwarepakker, der følger med kameraet. Kommercielle softwarepakker understøtter et stort antal hardware periferiudstyr, som kan gennemføres med lidt teknisk knowhow.
Puls generator dataopsamling (DAQ) bord (med analoge og digitale output kanaler) og oscilloskop: En puls generator er enfremragende valg til at konvertere triggerimpulser til impulser med defineret tid og spænding. Denne måde lasere kan styres præcist for udgangseffekt og timet i millisekund til sub-millisekunder. DAQ brædder med analoge udgange opnå samme og er let integreret i computerens bundkort via PCI slots. Pulse varighed, amplitude og frekvens kontrolleres med et oscilloskop.
Kabinet af hele excitation strålegangen: For at undgå udsving i excitation profilen grund af luft Konvektionsriste hele excitation strålegangen bør lukkede fra dets laboratorium miljø. Denne foranstaltning er især vigtigt, når der udføres TIRF mikroskopi. Optiske komponenter er også beskyttet mod støv og det menneskelige øje fra laserlys eksponering. Anlæggene kan være nemt bygge fra sort kort bord, som kan købes i kunst levering butikker.
Til bestemmelse af viskositeten af SLB Fluorescens Recovery Efter Photobleaching (FRAP) målinger 12 udføres. Er eksistensen af to excitation strålebaner for FRAP tilrådeligt (se figur 3). Den første strålebane er designet til at afbilde fluorescens af dobbeltlaget. Dette kan gøres i TIRF konfiguration og med en lav lysintensitet. Den anden strålegang bør give mulighed for en kort, men intens blegemiddel puls og skal konfigureres i ikke-TIRF tilstand, således at den forlader mål langs den optiske akse. En rund blænde kan placeres i excitationsstrålen sti (se figur 8) at projicere et perfekt rund blegemiddel profil med definerede kanter. For at billedet denne åbning på objektplanet, ville dens optimale position være i brændplanet af linsen 3 (se figur 3). Men på grund af den lange brændvidde på denne linse, en åbning, der er tilstrækkelig kvalitet kan også genereres, når åbningen er placeret ved lidt forskudt positioner.
Efter at have udført than billedbehandling eksperiment de rå data skal analyseres korrekt. Flere trin-for-trin-protokoller tilbydes, som dækker tilpasningen af de vigtigste indstillinger (f.eks belysning magt og tid, TIRF vinkel), erhverve og analysere dataene.
Enkelt molekyle mikroskopi giver en enestående mulighed for at studere opførslen af proteiner i deres oprindelige cellulære miljø. Molekylær billeddannelse bliver derfor mere og mere attraktiv for en bred videnskabelige samfund, men mange liv forskerne stadig vige tilbage fra den oprindelige investering i teknologi og ekspertise. Den vigtigste fordel ved montage ens eget imaging system er, at det let kan tilpasses til alle specifikke behov.
Som foreslået heri en ikke-TIRF excitation stråle kan let gennemføres ud over en eksisterende TIRF strålegang, hvis hurtig og defineret foto-blegning (eller -activation) af fluoroforer og ligander ønskes, f.eks når du udfører FRAP eller ligand uncaging eksperimenter 14 . Indførelsen af en emission stråledeler muliggør samtidig optagelse af mindst to og i nogle tilfælde op til fire fluorescerende kanaler. Listen over udvidelser er i det væsentlige kun begrænset afens egen fantasi.
For eksempel, at gennemføre en motoriseret emission filterhjulet i emissionen vej muliggør hurtig skift mellem op til ti forskellige fluorescerende kanaler. Når man kombinerer to motoriserede emission filter hjul (hver er udstyret med 10 filter slots) i serie, op til 18 fluorescerende kanaler kan udlæses. TIRF-baserede imaging kan suppleres med calcium mobilisering målinger og Interferens Reflection Microscopy (IRM) efter integration af en Xenon eller Mercury excitation lampe sti. IRM er den foretrukne metode til at visualisere i hvilken grad celler er bundet til glasoverfladen eller SLB og kan dermed give vigtig information, når TIRF-baserede billeddata tolkning. Etablering af en udvidet excitationsstråle med brug af en simpel dikroisk spejl og en yderligere laser på 405 nm tillader udførelse fotoaktivering lokalisering mikroskopi (PALM) eller stokastisk optisk mikroskopi genopbygning (storm), dvs. to superresolution metoder med en positionsnøjagtighed under diffraktionsgrænsen af synligt lys 15,16.
Men eksperimentel succes er ikke kun et spørgsmål om passende hardware. For at få fuldt udbytte af støj-reduceret TIRF-baserede imaging, bør celler tage kontakt til en overflade på en måde, der ikke pålægger begrænsninger på celleoverfladen eller der forstyrrer fysiologi deres plasmamembranen. SLBs funktionaliseret med passende proteiner til celleadhæsion overskrider velegnet til dette formål, fordi alle SLB-indlejrede ligander er sideværts mobile og justere deres laterale position inden dobbeltlaget i respons på receptorbinding og segregation dynamik.
At fremstille SLBs på en reproducerbar måde, er det bedst at starte ud med SUV'er med høj renhed. Som beskrevet heri, er det således afgørende at fjerne multilamellare vesikler, der også fremstilles under lydbehandling i to trin ultracentrifugering som disse interfere med dannelsen af sammenhængende SLBs featuring høj flydeevne. SLBs formelle høj kvalitet kun på rene glasflader. Når renset objektglas bør anvendes straks eller opbevares i vakuum. Vigtigt er det, skal SLBs aldrig udsættes for luft, da dette ville føre til deres forstyrrelser. SLB vask indebærer, som vist, puffer skylning med anvendelse af en serologisk pipette, da dette er ikke kun en, men også sparer tidsbesparende procedure.
Under høst og oprensning af SLB-hjemmehørende proteiner bør undgås brugen af rengøringsmidler. Dette skyldes detergent vil reducere protein mobilitet væsentligt, selv når de findes i spormængder. For at omgå behovet for detergent alle sammen, er opløselig ekspression af secerneret polyhistidinmærke udstyret ligander anbefales i mammale celler eller insektceller. Hvis genfoldning fra E.coli inklusionslegemer er påkrævet, skal der udvises forsigtighed anvendes til at fjerne vaskemidler effektivt fra inklusionslegemerne forud for deres un- og genfoldning.
En væsentlig fordel ved anvendelse af SLBs resultater fra deres modulære og reconstitutive karakter, som gør det muligt at specifikt dissekere rollen som en given receptor-ligand interaktion for celleaktivering og celleadhæsion. I denne forbindelse er det vigtigt at nævne, at DGS NTA-Ni bør være til stede ved 10% inden for SLB med henblik på at forhindre proteiner konkurrerer om NTA-Ni bindingssteder. Når der anvendes SLBs huser kun 1% eller 2% DGS NTA-Ni, en reduktion i sammenslutningen af de en given polyhistidin-mærkede protein arter kan blive bemærket, især ved samtidig inkubation stigende mængder af et andet polyhistidin-mærket proteinarter (upubliceret observation). Dette fænomen er ikke observeret, når du arbejder med SLBs featuring 10% DGS NTA-Ni.
Mens vi aldrig har observeret uspecifik binding af en hvilken som helst testet til SLBs indeholder DGS NTA-Ni polyhistidin-mærkede protein, bør denne mulighed skal testes, når der indføres et protein for første gang,Til dette formål anbefaler vi brug af SLBs blottet for DGS NTA-Ni (proteinet skal ikke binde). For det andet, når der anvendes et SLB indeholder DGS NTA-Ni, bør proteinet kommer ud helt efter vask SLB med PBS indeholdende 300 mM imidazol.
En anden væsentlig fordel ved at ansætte SLBs er, at forbigående interaktioner, signalpaneler begivenheder kan overvåges med forbedret Spatiotemporal opløsning 17-19. Dette er i det mindste delvis, fordi en tredimensional bindingsprocessen væsentlige er reduceret til to billeddannende dimensioner, især ved optagelse i støj-svækket TIRF tilstand. Brugen af SLBs er forenelig med detektion enkelt molekyle signal, en forudsætning for foto-aktiveret lokalisering mikroskopi (PALM) eller stokastisk optisk mikroskopi genopbygning (storm), dvs. superresolution mikroskopi med en opløsning under diffraktionsgrænsen 15,16. Disse særlige billeddiagnostiske metoder gør det muligt enkelt molekyle Förster Resonance Energy Transfer eksperimenter designet til at visualisere individuelle protein-protein interaktioner i et synaptisk miljø 20. Denne fremgangsmåde er forklaret meget detaljeret i en publikation JOVE betegnet "Måling TCR-pMHC binding under anvendelse et FRET-baseret assay mikroskopi" 21.
Ved fortolkning SLB-baserede eksperimenter bør man altid huske på, at ikke alle egenskaber ved et plasma membran af en levende celle er featured af SLBs, og at nogle af de manglende kvaliteter kan påvirke fysiologi under efterforskning. Efter alt, er SLB-indlejrede proteiner frit diffundere og ikke organiseret i membran mikrodomæner som de fleste af deres cellulære modstykker er 5,6,22. Immobiliseret plasmamembran-ark afledt af adhærente celler, som bevare plasmamembranen arkitektur levende celler til en vis grad, er blevet succesfuldt anvendt til at undersøge optagelsen fra membran-indlejrede antigener ved B-lymfocytter 23. Men selv sådannemembraner ikke interagerer med en meget dynamisk cytoskelet og har ingen fleksibilitet, da de understøttes af en stiv glasoverflade. I betragtning af disse uoverensstemmelser er der et klart behov for Engineering SLBs, som tilbyder midler til at inddeler proteiner i en defineret måde, og som understøttes af overflader af justerbar fleksibilitet eller ved overflader, der ændrer deres stivhed som reaktion på lokalt anvendte lysimpulser.
The authors have nothing to disclose.
MA blev understøttet af en Schrödinger fællesskab af Austrian Science Fund (FWF, J3086-B11) og tak Max-Planck-Society for finansiel og administrativ støtte. GS blev støttet af Wien Videnskab og Teknologi Fund (WWTF, LS13-030). JH blev støttet af Wien Videnskab og Teknologi Fund (WWTF, LS14-031).
#1.5 glass slides | VWR | 631-0853 | |
250ml round bottom flask | VWR | 201-1357 | |
50:50 beam splitter cubes | Thorlabs | BS013 | |
Acousto-opitcal modulator C1205-2 | Isomet | – | only necessary if CW lasers, which cannot be modulated, are used |
Alexa Fluor 488-NHS | Life technologies | A-20000 | |
Alexa Fluor 555-NHS | Life technologies | A-20009 | |
Alexa Fluor 647-NHS | Life technologies | A-20006 | |
autoclave tape | VWR | 489-1312 | or any other heat-stable sticky tabe |
Avanti Mini-Extruder | Avanti Lipids | 610000 | alternative to the bath sonicator |
bath sonicator QSONICA Q700 | QSONICA | Q700 | |
beam splitter | Cairn | P280/210/MLS | |
Büchi rotary evaporator | VWR | 531-0837 | |
camera | Andor | iXon Ultra 897 | see manuscript text for alternatives |
concentarted hydrogenperoxide | Roth | 9683.1 | |
concentrated sulfuric acid | Roth | X944.2 | |
epoxy glue | Uhu | 45705 | Uhu plus sofortfest 2min |
filter wheel | Sutter instruments | Lambda 10-2 | |
LabTek chambers | VWR | 734-2062 | |
laser | Toptica | – | different variants (wavelengths 375 – 785 nm) are available |
lens | Thorlabs, Newport | – | |
DGS NTA-Ni (lipid) | Avanti Lipids | 790404C | already in Choroform-solved delivered version of the nicekl salt variant is recommended |
POPC (lipid) | Avanti Lipids | 850457C | already in Choroform-solved delivered version is recommended |
microscope Zeiss Axiovert 200 | Zeiss | – | |
mirrors | Thorlabs | BB1-E02 | |
optical filters | AHF, Chroma, Semrock | – | filter sets are available for many different combinations of dyes |
oscilloscope | BK Precision | 2120C | |
phosphate buffered saline (PBS) | Life technologies | 14190-136 | degas before usage |
periscope | Thorlabs | RS99/M | |
picodent twinsil 22 | Picodent | 13001000 | alternative to the epoxy glue |
power meter Lasermate-Q | Coherent | – | any powermeter sensitive in the used spectral range will do |
pulse generator | Stanford Research Systems | SRS DG535 | |
spatial filter | Thorlabs | KT310/M | |
syringe filter 0.2µm | Millipore | GVWP04700 | |
TIRF-capable apochromat objective 100x, NA 1.46 | Zeiss | 440782-9800-000 | |
trichloromethane/chloroform | Roth | 3313.1 | |
tubes forultracentrifugation polycarbonate 1.00 mm, 11 mm x 32 mm | Thermo Fisher | 45237 | |
Sorvall ultracentrifuge | Thermo Fisher | RC M150GX | |
ultracentrifuge rotor | Thermo Fisher | S120-AT2 | |
UV spectrophotometer Nanodrop 2000c | Thermo Fisher | – | |
vacuum pump | VWR | 181-0248 |