Hier präsentieren wir ein Protokoll, das am Rückenmark Scheiben auf Multielektrodenarrays kultiviert, um funktionelle Regeneration propriospinale Verbindungen in vitro-Studie basiert.
Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a promising target for intervention to improve functional regeneration. So far, no in vitro model exists that grants the possibility to examine functional recovery of propriospinal fibers. Therefore, a representative model that is based on two organotypic spinal cord sections of embryonic rat, cultured next to each other on multi-electrode arrays (MEAs) was developed. These slices grow and, within a few days in vitro, fuse along the sides facing each other. The design of the used MEAs permits the performance of lesions with a scalpel blade through this fusion site without inflicting damage on the MEAs. The slices show spontaneous activity, usually organized in network activity bursts, and spatial and temporal activity parameters such as the location of burst origins, speed and direction of their propagation and latencies between bursts can be characterized. Using these features, it is also possible to assess functional connection of the slices by calculating the amount of synchronized bursts between the two sides. Furthermore, the slices can be morphologically analyzed by performing immunohistochemical stainings after the recordings.
Several advantages of the used techniques are combined in this model: the slices largely preserve the original tissue architecture with intact local synaptic circuitry, the tissue is easily and repeatedly accessible and neuronal activity can be detected simultaneously and non-invasively in a large number of spots at high temporal resolution. These features allow the investigation of functional regeneration of intraspinal connections in isolation in vitro in a sophisticated and efficient way.
Organotypischen Kulturen des zentralen Nervensystems (ZNS) haben intensiv genutzt worden, um verschiedene physiologische und pathologische Erscheinungen reichen von neuronalen Entwicklung zur Neurodegeneration zu untersuchen. Verglichen mit dissoziierten Zellkulturen bieten organotypischen Scheiben den Vorteil einer Komplexität, die mit einem intakten Zellarchitektur und lokaler Synapsenschaltungen. Gleichzeitig kann das Gewebe in einer isolierten Art und Weise ohne die Notwendigkeit, die Komplexität der gesamten in vivo Kontext impliziert analysiert werden. Darüber hinaus wird eine einfache und wiederholt den Zugriff auf die Zellen der Wahl erfordern, kann der extrazellulären Umgebung genau gesteuert werden kann und in der Regel sind in-vitro-Modellen weniger kostspielig als ihre in vivo-Gegenstücke. In den letzten Jahren stellte verschiedene Studien auffallende Ähnlichkeiten zwischen den Entwicklungsprofile der langen Zeitkulturen gegenüber den entsprechenden lebenden Tieren 1,2. Es wurde gezeigt, dass neuronaler Schaltkreise verschiedener ZNS regions Ausdruck spontaner Netzwerkaktivität während der Entwicklung und organotypischen Schnitten teilweise dieses Phänomen 3 -7 erhalten. Isolated Rückenmarks Vorbereitungen insbesondere eingesetzt, um Rhythmuserzeugung 6 und die Bildung von neuronalen Schaltkreisen 1 zu untersuchen.
Ein Weg, um die spontane Aktivität organotypischen Scheiben aufnehmen soll Kultur sie oben auf Multielektrodenanordnungen (MEAs). Diese Geräte enthalten mehrere Elektroden, die die extrazellulären Potentiale von Aktionspotentialen aus zahlreichen Zellen gleichzeitig (Multi-Unit-Aufnahme) erzeugt überwachen können. Die hohe zeitliche Auflösung der MEA-Aufnahmen verwendet werden, um die genauen Aktivitätsdynamik innerhalb eines bestimmten neuronalen Schaltkreis zu rekonstruieren. Zusätzlich, im Gegensatz zu Patch-Clamp die Technik ist nicht-invasiv, was Langzeitmessungen und führt zu der Tatsache, daß Neuronen in ihrem Verhalten nicht beeinträchtigt ermöglicht.
Foder das Ziel dieser Studie war die Kombination von organotypischen Rückenmarks Kokulturen und auf mehrere Aufnahmen wurde zur funktionellen Regeneration innerhalb des Rückenmarks zu untersuchen. Seit Erwachsenen höheren Wirbeltieren haben Potenzial, sich nach Schäden des Rückenmarks beschränkt erholen, haben unterschiedliche Strategien untersucht, um die Regeneration nach Verletzungen des Rückenmarks zu fördern. Bisher hat sich die Pyramidenbahn in der Regel für solche Untersuchungen war die Modellsystem der Wahl. Diese Experimente sind in der Regel zeitaufwendig, teuer und erfordern große Tier Kohorten aufgrund der hohen Variabilität innerhalb einzelnen Gruppen. Darüber hinaus Hinweise darauf, dass propriospinale Anschlüsse (Neuronen, die vollständig innerhalb des Rückenmarks beschränkt sind) können eine entscheidende Rolle bei der Wiederherstellung nach Rückenmarksverletzungen 8 zu spielen. Diese Fasern lassen sich nur schwer in vivo ohne die Einmischung und absteigenden Faserbahnen zu untersuchen. Bonnici und Kapfhammer 9 verwendet LängsrückenmarksSchnittkulturen der postnatalen Mäusen als alternativer Ansatz. Nach der Durchführung mechanische Läsionen sie analysiert semiquantitativ die morphologische Regeneration von Axonen zwischen Rückenmarksegmente. Sie beobachteten, weniger, aber nicht keine Axone Querung der Läsion in in einem reifen Alter schneiden Kulturen. Im Gegensatz dazu Kulturen, die in einem jüngeren Stadium lädierten wurden angezeigt, eine hohe Menge an axonale Regeneration 5-7 Tage nach der Beschädigung. Allerdings Beweis für funktionelle Verbindungen wurde nicht vorgelegt.
Daher kann die Entwicklung eines Vertreters in vitro-Modell der propriospinale Fasern, die die Untersuchung der funktionalen Regeneration kann ein wertvolles Werkzeug, um das Wissen über Regenerationsprozesse im Rückenmark zu verlängern.
Mehrere Elemente in der angegebenen Verfahren sind von grundlegender Bedeutung für die Durchführung von genauen und reproduzierbaren Experimenten. Alle Schritte bei der Herstellung der MEAs, Lösungen und die Herstellung der Scheibe Kulturen werden unter sterilen Bedingungen in einer Sterilbank durchgeführt. Antibiotika werden nicht zu dem Nährmedium angewendet werden, weil sie die spontane Aktivität 14 beeinflussen können. Während der MEA-Beschichtung, der wichtigste Teil ist, um sicherzustellen, dass die extrazelluläre Matrix-Gel-Lösung bleibt kalt zu allen Zeiten. Tauwetter in den Kühlschrank und halten Sie sie auf Eis für das gesamte Verfahren, um eine maximale Temperatur von etwa 0 ° C zu gewährleisten. Während der Vorbereitung der Scheiben schnelle Isolierung und Schnitte sowie die Aufmerksamkeit auf einer niedrigen Temperatur unter Verwendung von eiskaltem Dissektion Puffer erhöht den Prozentsatz der gesunden Kulturen. Darüber hinaus ist die Plasma / Thrombin-Gerinnungs einer der kritischen Schritte. Stellen Sie zunächst sicher, dass das Plasma ist richtig mixed mit dem Thrombin. Zweitens, ein besonderes Augenmerk auf die Beseitigung so viel Rückstand wie möglich, um die ordnungsgemäße Befestigung der Scheiben zu den MEAs zu gewährleisten. Dieser Schritt ist äußerst zeitempfindlich; wenn der Zeitraum zu kurz ist, zu viel von dem Plasma / Thrombin-Mischung entfernt wird. Wenn der Zeitraum zu lang ist, die Koagulation bereits geschehen, wodurch das Risiko des Entfernens der Scheiben zusammen mit dem Restplasma / Thrombin.
Wenn mechanische Läsionen geplant sind, ist es wichtig, MEAs mit einer genauen Design zu verwenden. Der Bereich, in dem die Läsion soll muss frei von Elektroden, Drähte und Isolation zu sein. Andernfalls werden die Elektrik der MEA geht, beschädigt zu werden, und daher kann keine Aufnahmen mehr durchgeführt werden.
Ein weiterer entscheidender Schritt betrifft die Größe der Läsion. Es wurde bereits früher, dass der Wiederverbindung zwei junge Scheiben nach Läsion dauert etwa zwei Tage 10 gezeigt worden. Bei allen Versuchen wurde die Faustregel, dass der Raum betwe verwendeten der Scheiben nach der Läsion sollte nicht größer als die Breite des MEA Nut (300 & mgr; m) betragen. Eine größere Läsionsgröße könnte in einem längeren Zeitrahmen für die Wiederverbindung führen, oder, wenn die Läsion ist zu groß, keine Wiederverbindung überhaupt. Zu kommentieren, zeigte früheren Versuchen, dass eine anfängliche Platzierung der zwei Scheiben weiter als 1 mm ergibt sich eine sehr geringe Verbindungsgeschwindigkeit.
Vor Beginn der Aufnahmen einer Anpassungszeit von mindestens 10 min auf RT statt bei 37 ° C des Inkubators, und die extrazelluläre Lösung, anstelle des Nährmedium wird empfohlen. Die genaue Beobachtung des Aktivitätsmuster in diesen ersten Minuten gewährleistet, dass die Messdaten stellen den Platzen Muster der Kultur angemessen Nachdem die Aufnahme gestartet.
Für die Detektion der Aktivität, Datenerfassung und Weiterverarbeitung, hausgemachte Hardware (Aufnahmekammer, Verbindungen zu den Verstärkern und Verstärker), Programme im LabVIEW, C ++ und IgorPro verwendet. Kommerzielle MEA-Setups und andere Software-Pakete sind auch für diese Vorgänge geeignet. Hier werden die Signale von den Elektroden gesehen 1001-fach verstärkt und dann digitalisiert mit einer Rate von 6 kHz.
Das vorgestellte Modell kann ein hilfreiches Werkzeug, um propriospinale Verbindungen zu untersuchen, da in vivo, schwierig, ohne die Einmischung der auf- und absteigenden Faserbahnen zu studieren sind. Die Co-Kultivierung von zwei Rückenmarksscheiben können dieses Problem elegant zu umgehen. Die Kulturen eine Mikroumgebung, die eng gesteuert werden kann und leicht zu manipulieren. Auf der anderen Seite, ist natürlich fehlen supraspinale und sensorischen Input. Zusätzlich kann das Verfahren der Kulturansatz stellt eine Situation der ZNS-Schädigung. Gliazellen Astrozyten und Mikroglia, wie bekannt, um Läsionen mit einer erhöhten Proliferation und damit zu reagieren, wird das Gewebe in einem gewissen Ausmaß neu geordnet. Im Zusammenhang mit der vorgeModusl die Bildung einer glialen Narbe nach der Durchführung mechanische Läsionen wurde nicht beobachtet. Eine Erklärung könnte sein, dass adaptive Mechanismen Astrozyten wurden bereits während des Herstellungsverfahrens ausgelöst und Läsionen der Kulturen nicht zu einer weiteren Reaktion führen. Auch gibt es keinen Beweis für die Beteiligung von Myelin assoziierten Inhibitoren, z. B. Nogo-A, in der niedrigen Regenerationspotential der Kulturen im hohen Alter Läsion. Jedoch wurde gezeigt, dass die Behandlung mit dem Phosphodiesterase-4-Inhibitor Rolipram, beginnend unmittelbar nach der Durchführung Läsionen bei 23 DIV zunimmt funktionelle Regeneration zwischen den Scheiben 10 dargestellt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die funktionelle Wiederherstellung kann in alten Kulturen erhöht. Spürbar, wenn das Zählen der Anzahl von Axonen Querung der Läsion, keinen Unterschied zwischen den Kulturen in einem jungen Alter lädierten und Kulturen im hohen Alter lädierten entdeckt wurde. Diese Ergebnisse legen nahe, dass fehlende axonale Regeneration ist nicht der Hauptgrund foder der Verlust der Erholung nach späten Läsionen in der Kultur und damit unterstreichen die Notwendigkeit für ein Modell, das die funktionelle Analyse der Regeneration ermöglicht. Synaptic Bildung und synaptische Plastizität könnte eine wichtige Rolle bei der Wiederherstellung 10 zu spielen. Diese Mechanismen gewonnen viel Aufmerksamkeit in den letzten Jahren, und es ist heute allgemein anerkannt, dass sie einen großen Einfluss auf das Ergebnis nach einer Rückenmarksverletzung zu haben. Daher kann ein Modell, das stabilen Bedingungen bietet, um diese Prozesse in Isolation und in allen Einzelheiten zu untersuchen sicherlich dazu beitragen, Erkenntnisse über funktionelle Regeneration im Rückenmark zu erhalten.
The authors have nothing to disclose.
This study was supported by the Swiss National Foundation (n° 3100AO-120327 and 31003A_140754/1)
Planar multielectrode array | Qwane Biosciences | custom-made according to the design of our lab | |
Nutrient medium | For 100 ml | ||
Dulbeccos modified Eagle's medium | Gibco | 31966-021 | 80 ml |
Horse serum | Gibco | 26050-070 | 10 ml |
distilled, sterile water | 10 ml | ||
Nerve growth factor-7S [5ng/mL] | Sigma-Aldrich | N0513 | 200 µl |
reconstituted in wash solution with 1% BSA | |||
Coating solution | |||
Extracellular matrix gel | BD Biosciences | 356230 | Must stay cold at all times; dilute 1:50 with medium optimized for prenatal and embryonic neurons |
medium optimized for prenatal and embryonic neurons | Gibco | 21103-049 | |
Wash solution | [mg/L] | ||
MgCl2-6H2O | 100 | ||
MgSO4-7H2O | 100 | ||
KCl | 400 | ||
KH2PO4 | 60 | ||
NaCl | 8000 | ||
Na2HPO4 anhydrous | 48 | ||
D-Glucose (Dextrose) | 1000 | ||
According to the protocol on http://www.lifetechnologies.com/ch/en/home/technical-resources/media-formulation.152.html | |||
Extracellular solution (pH 7.4) | [mM] | ||
NaCl | 145 | ||
KCl | 4 | ||
MgCl2 | 1 | ||
CaCl2 | 2 | ||
HEPES | 5 | ||
Na-pyruvate | 2 | ||
Glucose | 5 | ||
Blocking Solution | |||
Detergent: Triton X-100 | 0.3%, harmful if swallowed | ||
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | 1% |
Goat serum | Gibco | 16210-064 | 5% |
Chicken Plasma | Sigma-Aldrich | P2366 | Lyophilized, reconstitute with wash solution |
Gabazine | Sigma-Aldrich | SR-95531 | |
Mecamylamine hydrochloride | Tocris | 2843 | toxic if swallowed |
Micropipette | World Precision Instruments, Inc. | MF28G-5 | |
Paraformaldehyde | harmful, 4% | ||
SMI-31 | Covance | SMI-31P | |
SMI-32 | Covance | SMI-32R-500 | |
Strychnine | Sigma-Aldrich | S0532 | toxic |
Thrombin | Merck Millipore | 1123740001 | irritant, sensitizing, reconstitute with wash solution |
Tissue culture flat tube 10 (= roller tube) | Techno Plastic Products AG | 91243 |