כאן אנו מציגים פרוטוקול המבוסס על פרוסות חוט השדרה בתרבית על מערכים רב-אלקטרודה ללמוד התחדשות פונקציונלית של קשרי propriospinal במבחנה.
Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a promising target for intervention to improve functional regeneration. So far, no in vitro model exists that grants the possibility to examine functional recovery of propriospinal fibers. Therefore, a representative model that is based on two organotypic spinal cord sections of embryonic rat, cultured next to each other on multi-electrode arrays (MEAs) was developed. These slices grow and, within a few days in vitro, fuse along the sides facing each other. The design of the used MEAs permits the performance of lesions with a scalpel blade through this fusion site without inflicting damage on the MEAs. The slices show spontaneous activity, usually organized in network activity bursts, and spatial and temporal activity parameters such as the location of burst origins, speed and direction of their propagation and latencies between bursts can be characterized. Using these features, it is also possible to assess functional connection of the slices by calculating the amount of synchronized bursts between the two sides. Furthermore, the slices can be morphologically analyzed by performing immunohistochemical stainings after the recordings.
Several advantages of the used techniques are combined in this model: the slices largely preserve the original tissue architecture with intact local synaptic circuitry, the tissue is easily and repeatedly accessible and neuronal activity can be detected simultaneously and non-invasively in a large number of spots at high temporal resolution. These features allow the investigation of functional regeneration of intraspinal connections in isolation in vitro in a sophisticated and efficient way.
תרבויות פרוסה Organotypic של מערכת העצבים המרכזית (CNS) נעשו שימוש נרחב ללמוד תופעות פיסיולוגיות ופתולוגיים שונות להגיע מפיתוח עצבי לניוון של מערכת עצבים. בהשוואה לתרביות תאים ניתק, פרוסות organotypic מציעות את היתרון של יותר מורכבות עם cytoarchitecture שלם ומעגלים הסינפטי מקומיים. במקביל, הרקמות ניתן לנתח באופן מבודד ללא הצורך לסבך את המורכבות של כל בהקשר vivo. יתר על כן, גישה קלה וחזרה לתאים של בחירה היא מוצדק, הסביבה תאית ניתן לשלוט באופן מדויק, ובדרך כלל, במבחנה דגמים פחות יקרים מאשר עמיתיהם בvivo. בשנים האחרונות, מחקרים שונים המוצגים דמיון בולט בין הפרופילים ההתפתחותי של תרבויות לטווח ארוכות לעומת בעלי החיים המקבילים החיים 1,2. הוכח כי מעגלים עצביים של מערכת העצבים המרכזית Regio השוניםNS להביע פעילות רשת ספונטנית במהלך פיתוח ושפרוסות organotypic חלקית לשמור תופעה זו 3 -7. הכנות חוט השדרה מבודדות כבר בשימוש במיוחד כדי לחקור דור קצב 6 והיווצרות של מעגלים עצביים 1.
דרך כדי להקליט את הפעילות הספונטנית של פרוסות organotypic היא תרבותם על גבי מערכים רב-אלקטרודה (MEAs). מכשירים אלה מכילים אלקטרודות מרובות שיכול לפקח על הפוטנציאל תאי שנוצר על ידי פוטנציאל פעולה ממספר רב של תאים בו זמנית (הקלטה רבת-יחידה). הרזולוציה הגבוהה הזמנית של הקלטות MEA ניתן להשתמש כדי לשחזר את דינמיקת הפעילות המדויקת בתוך מעגל עצבי נתון. בנוסף, בניגוד לתיקון-מהדקת את הטכניקה הוא לא פולשנית, המאפשר מדידות ארוכת טווח ותוצאות בעובדה שתאי עצב אינם מושפעים בהתנהגות שלהם.
Fאו מטרתו של מחקר זה, השילוב של שיתוף תרבויות חוט השדרה organotypic והקלטות מרובות אתרים שימש לחקור התחדשות פונקציונלית בתוך חוט השדרה. מאז חוליות גבוהות מבוגרות יש פוטנציאל להתאושש מנזק של חוט השדרה מוגבלת, אסטרטגיות שונות נחקרו לקידום התחדשות לאחר פגיעה בחוט השדרה. עד כה, בדרכי corticospinal יש בדרך כלל היו מערכת המודל של בחירה לחקירות כאלה. ניסויים אלה הם בדרך כלל זמן רב, יקר ודורשים קבוצות בעלי חיים גדולות בשל שונות גבוהות בתוך קבוצות יחידה. יתר על כן, ראיות מצביעות על כך שקשרי propriospinal (נוירונים שכלואים לגמרי בתוך חוט השדרה) יכולים לשחק תפקיד מרכזי בתהליך ההתאוששות הבא נגעים בחוט השדרה 8. סיבים אלו הם קשים ללמוד in vivo ללא ההתערבות של עולה ויורדים שטחי סיבים. Bonnici ו -9 Kapfhammer משמשים חוט השדרה אורךתרבויות פרוסה של עכברים לאחר לידה כגישה חלופית. לאחר ביצוע נגעים מכאניים הם ניתחו חצי כמותית התחדשות מורפולוגי של אקסונים בין מגזרי חוט השדרה. הם נצפו אקסונים אף פחות אך לא חוצים את אתר הנגע בתרבויות לחתוך בגיל בוגר. לעומת זאת, תרבויות שlesioned בשלב צעיר מוצגות כמות גבוהה של התחדשות axonal 5 – 7 ימים לאחר הפגיעה. עם זאת, הוכחה לקשרים פונקציונליים לא הוצגה.
לכן, הפיתוח של נציג במודל חוץ גופית של סיבי propriospinal המאפשר החקירה של התחדשות פונקציונלית יכול להיות כלי רב ערך ללהרחיב את הידע שלנו על תהליכי התחדשות בחוט השדרה.
כמה גורמים בהליך שהוצג הם יסוד להישג של ניסויים מדויקים ושחזור. כל הצעדים במהלך תקופת ההכנה של MEAs, הפתרונות והייצור של התרבויות הפרוסה מבוצעים בתנאים סטריליים בזרימה למינרית. אנטיביוטיקה אינה חלה על המדיום מזין, כי הם יכולים להשפיע על הפעילות הספונטנית 14. במהלך ציפוי MEA, החלק החשוב ביותר הוא לוודא כי פתרון ג'ל מטריקס נשאר קר בכל העת. הפשירי אותו במקרר ולשמור אותו על קרח לכל התהליך כדי להבטיח טמפרטורה מקסימלי קרובה ל 0 מעלות צלזיוס. במהלך תקופת ההכנה של הבידוד מהיר פרוסות וחתך, כמו גם תשומת הלב משלם לטמפרטורה נמוכה על ידי שימוש במאגרי נתיחה קרים קרח מגדיל את אחוז התרבויות הבריאים. יתר על כן, הקרישה / תרומבין הפלזמה היא אחד השלבים הקריטיים ביותר. ראשית, ודא שהפלזמה היא mixe כראויד עם תרומבין. שנית, להקדיש תשומת לב מיוחדת להסרת כמה שיותר שאריות ככל האפשר כדי להבטיח מצורף תקינה של פרוסות לMEAs. שלב זה הוא מאוד רגיש לזמן; אם מסגרת הזמן קצרה מדי, יותר מדי מתערובת הפלזמה / תרומבין מוסר. אם מסגרת הזמן ארוכה מדי, קרישה כבר קרה, מעלה את הסיכון להסרת פרוסות יחד עם הפלזמה / תרומבין השייר.
אם נגעים מכאניים מתוכננים, חשוב להשתמש MEAs עם עיצוב מדויק. האזור שבו הנגע מיועד צריך להיות חופשי של אלקטרודות, חוטים ובידוד. אחרת, החשמל של MEA הולך להיות פגום ולכן, יכולות להתבצע ללא הקלטות יותר.
עוד צעד מכריע נוגע לגודל הנגע. זה כבר הראה בעבר כי חיבור מחדש שתי פרוסות צעירות לאחר הנגע לוקח בערך יומיים 10. לכל הניסויים, כלל אצבע ששמש betwe החללen פרוסות לאחר נגע לא צריך להיות גדול יותר מאשר הרוחב של חריץ MEA (300 מיקרומטר). גודל נגע גדול יותר עלול לגרום למסגרת זמן ארוכה יותר לחיבור מחדש או, אם הנגע הוא גדול מדי, אין חיבור מחדש בכל. כדי להוסיף הערות, ניסויים לשעבר חשפו כי הצבה ראשונית של שתי פרוסות רחוקות מתוצאות 1 מ"מ בשיעור חיבור נמוך מאוד.
לפני תחילת ההקלטות, זמן הסתגלות של לפחות 10 דקות לRT, במקום 37 מעלות צלזיוס של החממה, ולפתרון תאי, במקום בינוני התזונה מומלצת. תצפית קרובה של דפוס הפעילות בדקות אלה ראשוניים מבטיחה כי הנתונים שנמדדו מייצגים את דפוס התפוצצות התרבות כראוי לאחר ההקלטה החלה.
לצורך זיהוי של הפעילות, רכישת נתונים ועיבוד נוסף, חומרת תוצרת בית (הקלטה קאמרית, חיבורים למגברים והמגברים), התוכניות במעבדהVIEW, C ++ וIgorPro משמשים. הגדרות MEA מסחריות וחבילות תוכנה אחרות מתאימות, כמו גם לפעולות אלה. הנה, ראו האותות על ידי אלקטרודות מוגברות 1,001 פעמים, ולאחר מכן דיגיטציה בשיעור של 6 קילו-הרץ.
המודל שהוצג יכול להיות כלי מועיל לבחון קשרי propriospinal כי in vivo, הם קשים ללמוד בלי ההפרעות של עולה ויורדים שטחי סיבים. שיתוף culturing של שתי פרוסות חוט השדרה יכול לעקוף באלגנטיות נושא זה. התרבויות לספק מייקרו-סביבה שיכולה להיות מבוקר היטב ובקלות מניפולציות. מצד השני, קלט supraspinal והחושי הוא כמובן חסר. בנוסף, בתהליך של הכנת התרבות מייצג מצב של נזק במערכת העצבים המרכזית. תאי גלייה כמו האסטרוציטים ומיקרוגלים ידועים להגיב לנגעים עם התפשטות מוגברת ולכן, הרקמה היא ארגון מחדש במידה מסוימת. הנוגע למצב שהוצגl היווצרות צלקת גליה לאחר ביצוע נגעים מכאניים לא נצפה. הסבר אחד יכול להיות שמנגנוני הסתגלות של האסטרוציטים כבר מופעלים בתהליך ההכנה וכי נגעים של התרבויות לא לגרום לתגובה נוספת. כמו כן, אין ראיות למעורבותם של המעכבים הקשורים המיאלין, למשל., Nogo-, בפוטנציאל ההתחדשות הנמוך של תרבויות lesioned בזקנה. עם זאת, זה הראה כי טיפול במעכבים phosphodiesterase 4 Rolipram, מתחיל מייד לאחר ביצוע נגעים בהתחדשות תפקודית 23 DIV עליות בין הפרוסות 10. תוצאות אלו מראות כי התאוששות תפקודית יכולה להיות מוגברת בתרבויות עתיקות. ניכר, כאשר סופר את מספר אקסונים חוצים את אתר הנגע, אין הבדל בין תרבויות lesioned בגיל צעיר ותרבויות lesioned בזקנה התגלה. ממצאים אלה מראים כי חוסר התחדשות axonal הוא לא הסיבה העיקרית ואו האובדן של התאוששות לאחר נגעים מאוחר בתרבות ולכן מדגיש את הצורך במודל המאפשר ניתוח פונקציונלי של התחדשות. היווצרות Synaptic ופלסטיות הסינפטית יכולים לשחק תפקיד מרכזי בתהליך ההתאוששות 10. מנגנונים אלה צברו הרבה תשומת לב בשנים האחרונות וזה בימינו מקובל שיש להם השפעה משמעותית על התוצאה לאחר פגיעה בחוט השדרה. לכן, מודל המספק תנאים יציבים לחקור תהליכים אלה בבידוד ובפירוט רב בהחלט יכול לעזור להשיג תובנה על התחדשות פונקציונלית בחוט השדרה.
The authors have nothing to disclose.
This study was supported by the Swiss National Foundation (n° 3100AO-120327 and 31003A_140754/1)
Planar multielectrode array | Qwane Biosciences | custom-made according to the design of our lab | |
Nutrient medium | For 100 ml | ||
Dulbeccos modified Eagle's medium | Gibco | 31966-021 | 80 ml |
Horse serum | Gibco | 26050-070 | 10 ml |
distilled, sterile water | 10 ml | ||
Nerve growth factor-7S [5ng/mL] | Sigma-Aldrich | N0513 | 200 µl |
reconstituted in wash solution with 1% BSA | |||
Coating solution | |||
Extracellular matrix gel | BD Biosciences | 356230 | Must stay cold at all times; dilute 1:50 with medium optimized for prenatal and embryonic neurons |
medium optimized for prenatal and embryonic neurons | Gibco | 21103-049 | |
Wash solution | [mg/L] | ||
MgCl2-6H2O | 100 | ||
MgSO4-7H2O | 100 | ||
KCl | 400 | ||
KH2PO4 | 60 | ||
NaCl | 8000 | ||
Na2HPO4 anhydrous | 48 | ||
D-Glucose (Dextrose) | 1000 | ||
According to the protocol on http://www.lifetechnologies.com/ch/en/home/technical-resources/media-formulation.152.html | |||
Extracellular solution (pH 7.4) | [mM] | ||
NaCl | 145 | ||
KCl | 4 | ||
MgCl2 | 1 | ||
CaCl2 | 2 | ||
HEPES | 5 | ||
Na-pyruvate | 2 | ||
Glucose | 5 | ||
Blocking Solution | |||
Detergent: Triton X-100 | 0.3%, harmful if swallowed | ||
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | 1% |
Goat serum | Gibco | 16210-064 | 5% |
Chicken Plasma | Sigma-Aldrich | P2366 | Lyophilized, reconstitute with wash solution |
Gabazine | Sigma-Aldrich | SR-95531 | |
Mecamylamine hydrochloride | Tocris | 2843 | toxic if swallowed |
Micropipette | World Precision Instruments, Inc. | MF28G-5 | |
Paraformaldehyde | harmful, 4% | ||
SMI-31 | Covance | SMI-31P | |
SMI-32 | Covance | SMI-32R-500 | |
Strychnine | Sigma-Aldrich | S0532 | toxic |
Thrombin | Merck Millipore | 1123740001 | irritant, sensitizing, reconstitute with wash solution |
Tissue culture flat tube 10 (= roller tube) | Techno Plastic Products AG | 91243 |