ניתוח של<em> Enterocolitica Yersinia</em> מפעיל טרנסלוקציה לתאי מארח שימוש בטא לקטמאז מפעיל Fusions

III מערכות הפרשת סוג מכונות חלבון-יצוא מיוחד מנוצל על ידי genera של חיידקי גרם שלילי לספק ישירות חלבוני מפעיל מקודדים bacterially לתאי יעד האיקריוטים שונה. בעוד מכונות ההפרשה עצמו שמור ביותר, סטים מיוחדים של חלבוני מפעיל התפתחו בין מיני חיידקים השונים כדי לתפעל מסלולי איתות תאיים ולהקל אסטרטגיות אלימות חיידקים ספציפיות ^1. במקרה של Yersinia, עד שבעה חלבוני מפעיל, (חלבונים חיצוניים Yersinia) Yops שנקרא, הם translocated במגע תא מארח ולפעול יחד כדי לחתור תחת תגובות תא חיסון כגון ייצור phagocytosis וציטוקינים, כלומר, כדי לאפשר הישרדות תאית של החיידקים ^2-4. התהליך של טרנסלוקציה נשלט בחוזקה בשלבים שונים ^5. הוא קבע כי הפעלה ראשונית של T3SS מופעלת על ידי המגע שלה ליעד לספירהLL ^6. עם זאת, המנגנון המדויק של חניכה זו הוא עדיין לא הובהר. בYersinia רמה שנייה של מה שנקרא כוונון עדין של טרנסלוקציה מושגת על ידי למעלה או פעילות של חלבוני Rho GTP מחייב Rac1 הסלולריים או RhoA ויסות כלפי מטה. הפעלה של Rac1 למשל על ידי גורם necrotizing invasin או ציטוטוקסיות Y (CNF-Y) מובילה לטרנסלוקציה עלתה ^7-9, ואילו הפער (GTPase הפעלת חלבון) פונקציה של YopE translocated מסדירה את הפעילות-Rac1 ובהתאם יורד טרנסלוקציה ידי סוג משוב שלילי של מנגנון ^10,11.

שיטות תקפות ומדויקות הן התנאי ההכרחי כדי לחקור כיצד טרנסלוקציה מוסדרת במהלך האינטראקציה תא המארח Yersinia. מערכות רבות ושונות המשמשות למטרה זו, כל אחד עם יתרונות וחסרונות מסוימים. גישות יש להסתמך על תמוגה של תאים נגועים אך לא חיידקים על ידי חומרי ניקוי שונים ואחריו ניתוח כתם מערבי. החסרון משותף דואר של שיטות אלה הוא שתמוגה חיידקי קטין אך בלתי נמנעת שעלולה מזהמת את lysate התא עם הקשורים חיידקי חלבוני מפעיל. עם זאת, טיפול בתאים עם K proteinase להשפיל חלבוני מפעיל תאיים והשימוש הבא של digitonin לתמוגה סלקטיבית של התאים האיקריוטים הוצעו כדי למזער בעיה זו ^12. חשוב לציין, מבחני אלה תלויים באופן מכריע על נוגדנים נגד מפעיל באיכות גבוהה, שהם בעיקר לא זמינים באופן מסחרי. ניסיונות להשתמש שילובי translational של חלבוני מפעיל וחלבוני ניאון כמו GFP לעקוב אחר טרנסלוקציה לא היו מוצלחים ככל הנראה בשל המבנה הכדורי שיישונים של חלבוני הניאון וחוסר היכולת של מנגנון ההפרשה להתפתח לפני ההפרשה ^13. עם זאת תחום, כמה תגי כתב שונים כמו cya (cyclase adenylate calmodulin תלוי) של רעלן שעלת Bordetella cyclolysin ¹⁴ או פלאשתג שימש בהצלחה לניתוח טרנסלוקציה. בassay לשעבר הפעילות האנזימטית של cya משמשת כדי להגביר את האות של חלבון ההיתוך תאיים, ואילו תג פלאש, תג מוטיב tetracysteine ​​קצר מאוד (4Cys), מאפשר לתיוג עם פלאש הצבע biarsenical מבלי להפריע לתהליך של הפרשה ^15.

הגישה מיושמת כאן דווחה לראשונה על ידי שרפנטייה et al., והוא מבוסס על ההמרה תאית של CCF4 צבע תהודת העברת אנרגיית פורסטר (סריג) על ידי שילובי translocated מפעיל TEM-1 בטא לקטמאז ¹⁶ (איור 1 א). CCF4 / AM הוא תרכובת תא-permeant בי נגזר coumarin (תורם) ומחצית העמסה (acceptor) צמודות על ידי ליבת צפלוספורין. עם הכניסה פסיבית לתוך התא אוקריוטים, לא פלורסנט אסטרי מתחם CCF4 / AM מעובד על ידי esterases הסלולרי לCCF4 הטעון וניאון ולכודים ובכךבתוך התא. עירור של מחצית coumarin ב 405 ננומטר תוצאות בסריג למחצית והעמסת, אשר פולטת אותות הקרינה ירוקים ב530 ננומטר. לאחר המחשוף של ליבת צפלוספורין ידי סריג בטא לקטמאז מופר ועירור של מחצית coumarin מוביל לפליטת הקרינה הכחולה at460 ננומטר. יישומים שונים של שיטה זו תוארו בספרות הדגשה צדדיות שלה. השיטה מאפשרת ניתוח של טרנסלוקציה במבחנה וגם בin vivo, למשל, את הטכניקה הייתה בשימוש במודל זיהום עכבר כדי לזהות את אוכלוסיות יקוציט ממוקדות עבור טרנסלוקציה in vivo ^17-19. קריאת נתונים של אותות ניתן לבצע באמצעות קוראי צלחת, ניתוח FACS או מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ראוי לציין, השיטה מספקת גם את האפשרות לעקוב אחר טרנסלוקציה בזמן אמת על ידי מיקרוסקופ לחיות התאים במהלך ^20,21 תהליך ההדבקה. כאן מיקרוסקופ פלואורסצנטי סריקת הלייזר יושם לreadouלא של אותות הקרינה כפי שהוא מספק רגישות ודיוק הגבוהות ביותר. בפרט, את היכולת להתאים את חלון הפליטה עם דיוק ננומטר בשילוב עם גלאים גבוהים רגישים מקל מותאמת גילוי הקרינה ולמזער הצטלבות. בנוסף התקנת מיקרוסקופיה זה יכולה להיות מותאם לניטור של טרנסלוקציה בזמן אמת ובאופן פוטנציאלי מאפשרת לניתוח בו זמני של אינטראקציה מארח הפתוגן ברמה התאית.

בשיעורי טרנסלוקציה מחקר זה של י ' זן enterocolitica פראי סוג ומוטצית מחיקת YopE מציגה פנוטיפ hypertranslocator ^10,11 נותחו exemplarily.