Плазмиды, полученные ДНК замещения цепи Гейтс для реализации химической реакции сети

1. Последовательность Дизайн Примечание: обзор дизайн последовательности: В этом разделе, стратегия проектирования плазмиды, полученные ворота ДНК описано. Ферментные сайты, размещенные на любом конце ворот, чтобы для выпуска полностью двухцепочечных ворот после пищеварения. Перекреста сайты помещают таким образом, что ферменты создать ники на верхней нити, чтобы создать окончательные ворота ndsDNA. Наконец, остальные последовательности выбирают таким образом, что независимые домены являются ортогональными друг к другу и не проявляют вторичную структуру. Поместите перекреста сайт Nt.BstNBI четыре нуклеотида от конца 3 'каждой длинной домен (, B, C, R, и я). Поместите перекреста сайт Nb.BsrDI на 5 'конце каждого долгого домена (а, б, в, г. Обратите внимание, что домен я не имеет никакого Nb.BsrDI перекреста сайт). Рисунок 2C показывает детальный вид следования Присоединяйтесь AB и BC Вилка ворота. Поместите рестрикции PvuII сайт на обоих концах ndsDNA ворот, так что PvuII пищеварения может выпустить ворота из плазмид (см фиг.2с). Конструкция другие неограниченные последовательности, следуя двум принципам: (а) нити не должны показывать вторичные структуры (структуры ДНК может быть предсказано с помощью NuPack 41), и (б) все домены должны быть ортогональными, чтобы минимизировать перекрестные помехи. Поместите последовательности ndsDNA в центре шаблона ворота. Поместите 30-40 п.н. случайных последовательностей распорные на обоих концах шаблона затвора, каждая прокладка служит уникальным сайтом связывания для следующей полимеразной цепной реакции (ПЦР). 2. Клонирование NdsDNA Гейтс в плазмид Примечание: В этом разделе описывается метод клонирования Gibson для вставки 4 копии ворот в плазмиды позвоночника. Заказать ndsDNA шаблоны ворота как двухцепочечной геномной блоков от производителя ДНК (последовательности шаблона ворота показаныв таблице 1; Нити происходят в ndsDNA ворот приведены в таблице 2; последовательности на уровне домена, приведены в таблице 3). После получения ДНК, заказанный, спина пробирки, содержащие геномные блоки на 10,000-14,000 мкг в течение 1 мин, чтобы гарантировать, что все Высушенную ДНК находится в нижней части трубы. Ресуспендируют сушеные геномных блоков в ДНКазы без воды, чтобы достичь конечной концентрации 10 нг / мкл. Примечание: В качестве альтернативы, ДНК может быть снова суспендируют с помощью 1x Трис этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) буфера (буфера ТЕ: 10 мМ Трис и 1 мМ ЭДТА, рН 8,0). Тем не менее, ЭДТА хелатирующий агент для двухвалентных катионов и может ингибировать ПЦР. Создание 4 фрагментов ворота с разных регионов перекрытия с помощью стандартного ПЦР с High-Fidelity ДНК-полимеразы (рис 3а). Последовательности праймеров приведены в Табл 4 (температура плавления этих праймеров 62 ° С). Запуск 2% агарозном геле в 140 В в течение 30 мин при комнатной температуре (подробное агарозном геле протокола см 42) и сократить полос, соответствующих каждой амплификации методом ПЦР фрагмента из геля. Затем очистить ломтики гель, используя набора для экстракции гелей (пожалуйста, обратитесь к материалам) в соответствии с инструкциями изготовителя. Дайджест высокого числа копий плазмиды основу (см материалы) с PvuII-HF и PstI-HF при 37 ° С в течение 1 ч (таблица 5) в соответствии с протоколом производителя. PvuII-HF и PstI-HF высоки верность рестриктаз, которые резко сократить неспецифические сокращений. Запуск 1,5% агарозном геле и сократить линеаризованную позвоночник (как правило, запустить гель при 140 V в течение 30-40 мин при комнатной температуре). Затем извлечь ДНК из куска геля с использованием набора для экстракции геля в соответствии с инструкциями изготовителя. Выполните сборку Gibson 43 с линеаризованной вектора и очищенных ПЦР-фрагментов (табл 6 и рис 3B </stronг>) при 50 ° С в течение 1 часа. Преобразование сборки продукта со стадии Gibson 2,8 в кишечной палочки (E.coli) и пластины на лизогении бульон (LB) агаром, содержащих ампициллин антибиотики (при концентрации 100 мкг / мл). Выполните преобразование через электропорации или способом теплового шока 44,45, и использовать соответствующую Е. Штамм. Например, можно использовать Е. Штамм JM109 для теплового шока трансформации, и использовать DH5 & Электрокомпетентные Е. палочки для электропорации клетки. Примечание: Эту плазмиду использовали основой содержит кассету сопротивления к ампициллину. При использовании другого селективного маркера, использовать соответствующие антибиотики вместо ампициллина. 3. Бактериальные культуры Усиление и контроль качества Примечание: В этом разделе описывается массовое производство и выделение плазмид, содержащих ДНК ворота после контроля качества. Выберите одну колониюот ампициллин селективного пластины со стадии 2.9, и инкубируют культуры 3 мл обогащенной среды, содержащей ампициллин антибиотики (при концентрации 100 мкг / мл). Отметьте, что колонии, такие Она может быть использована снова в последующих экспериментальных этапов. Растут культуры при 37 ° CO / N с энергичного встряхивания (200-300 оборотов в минуту). Как правило, инкубировать в течение 16-24 ч. Извлечение ДНК плазмиды из бактериальной культуры с использованием мини-Prep Kit в соответствии с инструкциями изготовителя. Измерьте плазмидной ДНК с помощью спектрофотометра в соответствии с инструкциями изготовителя. Типичные диапазоны доходности от 50-1,000 нг / мкл. Получить извлеченный плазмидной ДНК секвенировали с помощью отправки образца в ДНК последовательностей компании. Праймеры для секвенирования должны быть расположены около 100 нуклеотидов выше и ниже области, подлежащие секвенированию; секвенирование грунтовка для плазмиды (см материалы для плазмиды) имеет следующую последовательность: ATTACCGCCTTTGAGTGAGC. НетTe: Если есть ошибка последовательность или рекомбинация в вставленной ndsDNA ворот, выберите другую колонию из пластины с шага 2.9. Последующие шаги 3.1-3.4, чтобы убедиться, что последовательности вставленных ворот верны. После проверки последовательности правильны, выбрать соответствующий колонию селективного пластины ампициллин (из стадии 2.9), и инкубируют культуры 800 мл бульона Terrific (ТБ), содержащей ампициллин антибиотики (при концентрации 100 мкг / мл). Выращивают культуру при 37 ° С в течение 16-24 ч, с энергичном встряхивании (200-300 оборотов в минуту). ТБ особенно хорошо подходит для высокодоходного производства плазмиды. Примечание: В качестве альтернативы, LB также могут быть использованы бактерии расти хотя выход плазмида может быть проблемой. Очищают ДНК с использованием Макси-Prep Kit в соответствии с инструкциями изготовителя. Следуйте шаг 3,3-3,4 проверить, правильны ли последовательности. Если какой-либо рекомбинация происходит, увидеть следующее примечание. В противном случае, переходите к шагу 4. <ш /> Примечание: Один из возможных проблема здесь в том, что несколько копий вставленных ворот в плазмиды могут рекомбинировать в результате ремонта ДНК. Чтобы решить эту проблему, используйте Е. Штамм не хватает белка RecA (белок связан с репарации ДНК), такие как JM-109 или DH5 & alpha превратить ранее последовательность-проверено плазмиды (т.е., без каких-либо ошибок последовательности и рекомбинации). Затем выберите один из колонии этой пластинки и проверить последовательность плазмиды, отправив образца в секвенирования ДНК компании. 4. Ферментативный Обработка Примечание: В этом разделе описывается процесс для переваривания плазмиды, так что они вырезать и порезал в правильных местах и ​​готовы быть использованы для кинетики экспериментов. Дайджест Очищенную плазмидную ДНК из стадии 3.7 рестриктазой PvuII-HF в течение 1 ч при 37 ° С (см таблицу 7). Обычно переварить плазмиду с 4 единицами PvuII-HF на 1 мг плазмиды. Высокая FIDферменты рестрикции elity рекомендуется для использования, так как они значительно уменьшить неспецифические сокращений. Выполнение осаждением этанолом на образце. Добавить 2 эквивалентные объемы ледяной абсолютного этанола к образцу. Выдержите смесь при температуре -80 ° С в течение по меньшей мере 1 ч (эта смесь также может сидеть при -80 ° С в течение O / N). Центрифуга на 10,000-14,000 мкг при 0 ° С в течение 30 мин. Удалить супернатант. Добавить 1000 мкл RT 95% этанола на образец, и инвертировать в 10-15 раз. Центрифуга на 10,000-14,000 мкг при 4 ° С в течение 10 мин. Удалить супернатант и сухой воздух на скамейке в течение 10-20 мин. Ресуспендируют гранул ДНК в соответствующем объеме нуклеазы свободного H 2 O (обычно 100-200 мкл). Добавление более 200 мкл, как правило, делают выборку слишком разбавленных для использования в экспериментах кинетики. Измерить ресуспендировали ДНК с помощью спектрофотометра, следующего за мИнструкции по anufacturer. Дайджест присоединиться ворота с уменьшение поперечного сечения фермента Nb.BsrDI при 65 ° С в течение 1 часа с использованием 4 единиц фермента на 1 мкг плазмиды (см Таблицу 8); дайджест вилки ворота с уменьшение поперечного сечения фермента Nt.BstNBI при 55 ° С в течение 1 часа с использованием 8 единиц фермента на 1 мкг плазмиды (см таблицу 9). Примечание: Шаг 4.2 удаляет фермента буфер пищеварение и помогает сосредоточиться ворота для кинетики экспериментов. Шаг 4.2 могут быть пропущены для присоединиться ворота, потому что оба фермента PvuII, ограничение ВЧ-и уменьшение поперечного сечения фермент Nb.BsrDI один и тот же буфер пищеварение. На шаге 4.2.8, нуклеазы свободной H 2 O используется вместо ТЕ потому ЭДТА хелатирующий агент для двухвалентных катионов и может ингибировать ферменты рестрикции, которые должны эти ионы функционировать. Примечание: добавление избыточных количеств ферментов может привести к высоким содержанием начального утечки цепи (рис 4), который, скорее всего, из-за чрезмерного пищеварения 46. Этот вопрос чап решить путем оптимизации ферментные суммы (рисунок 4). Типичный диапазон ферментов от 1-10 единиц / мкг плазмидной 1. 5. Подготовка одноцепочечной олигонуклеотидов Примечание: В этом разделе описывается протокол ресуспендированием и количественного химически синтезированные на одноцепочечной ДНК (оцДНК), который будет использоваться для сигнальных цепей и вспомогательных цепей. Для нити последовательностей см таблицу 10. Обратите внимание, что следующий протокол является примером подготовки 10 мкм оцДНК. Другие концентрации оцДНК можно получить аналогично. После получения олигонуклеотидов от производителя ДНК, спина пробирки, содержащие ДНК в 10,000-14,000 мкг в течение 1 мин, чтобы гарантировать, что все Высушенную ДНК находится в нижней части трубы. Ресуспендируют ДНК с использованием 1x Трис этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) буфере (ТЕ-буфера: 10 мМ Трис и 1 мМ ЭДТА, рН 8,0) до конечной концентрации 100 мкМ. ДляНапример, ресуспендируют 8 нмоль ДНК в 80 мкл ТЕ-буфера. Смешайте 10 мкл ДНК при 100 мкМ с 90 мкл молекулярной воды в микроцентрифужных трубки, которые должны достичь конечной концентрации 10 мкМ. Измерьте точную концентрацию образца ДНК с использованием спектрофотометра в соответствии с инструкциями изготовителя. Следующий протокол дает пример того, как концентрация ДНК может быть измерена. Бланк спектрофотометр с 2 мкл молекулярной воды. Измеряют поглощение при 260 нм (А 260) образца ДНК. Используйте следующее уравнение для расчета концентрации акций. Примечание: Концентрация образца М = коэффициент 260 / исчезновения. Коэффициент экстинкции можно найти на спецификации спецификации производителем ДНК. 6. Подготовка флуоресцентных Репортеры Примечание: В этом разделе описываетсяПротокол для приготовления Reporter C, флуоресцентные репортеры Другие могут быть собраны аналогично. Заказать высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), очищенный олигонуклеотидов ROX- <с * TC *> (верхняя нить Reporter С) и <с> -rq (нижняя нить Reporter C) от производителя ДНК (см таблицу 10 для последовательностей ). После получения синтезированных олигонуклеотидов, ресуспендируют и количественного образцы как описано в шаге 5. Смешайте репортер верхнюю и нижнюю нити (т.е. ROX- <с * TC *> и <с> -rq) в 1x Трис-ацетат-ЭДТА (TAE) с 12,5 мм Mg 2+ (см таблицу 11 для детального рецепта ). Обратите внимание, что здесь 30% избыток утоления помечены нити <с> -rq добавляется собрать репортер, который гарантирует, что все флуорофорные меченных пряди гасили даже с несовершенным стехиометрии. Отжиг репортер C комплекс с использованием термоциклера, охлаждение от 95 ° С до 20 ° С со скоростью 1 ° С / мин. Образцы можно хранить при температуре 4 ° С. 7. Измерения флуоресценции Примечание: раздел описывает общий протокол кинетики флуоресценции измерений (рисунок 5 для экспериментальной процедуры), и этот протокол будет использоваться на этапах 8, 9 и 10. Отметим также, что этот протокол для использования в спектрофлуориметре. Кроме того, эти эксперименты также могут быть выполнены в планшет-ридере, хотя чувствительность, хорошо в скважине вариации и отсутствие контроля температуры в долгосрочных экспериментов может быть проблемой. Установите регулятор температуры на 25 ° С, и ждать стабилизации температуры. Использование регулятора температуры могут уменьшить вариабельность в сигнал, который может возникнуть в результате изменения температуры. Установите правильные параметры FOг кинетика измерения в программном обеспечении сбора данных в спектрофлуориметре. Подробные параметры, например, являются следующие: Установите ширину щели до 2.73 нм для обеих возбуждения и эмиссии монохроматорами. Установить время интеграции до 10 сек для каждого 60 сек временной точке. Установите общее время измерения до 24 часов. Установка длины волн возбуждения / испускания чтобы соответствовать флуорофоров, используемых в эксперименте. Пример длины волн следующим образом: ROX (588 нм / 608 нм), TAMRA (559 нм / 583 нм). Добавить нуклеазы свободного H 2 O и 10-кратным Трис-ацетат-ЭДТА буфера, содержащего 125 мМ Mg 2+ (10x TAE / Mg 2+) к синтетическому кварцевую кювету. См Таблицы 12, 13, и 14 объемов, например, для использования. Добавить polyT пряди для достижения конечной концентрации ~ 1 мкМ (табл 12, 13, и 14 для объемов), а затем вихрь синтетическиекварцевые клетки для 10-15 сек. Вообще, наконечники будут неспецифически связывать ДНК. Добавление высоких концентраций polyT нитей может уменьшить этот неспецифического связывания ошибку. Добавить журналистам и вспомогательные жилы. Таблицу 12, 13, и 14 для объемов например, чтобы использовать. Обратите внимание, что для калибровки репортера, без вспомогательных пряди не нужны. Добавить 10% додецилсульфата натрия (SDS), чтобы достичь конечной концентрации 0,15% SDS. Примечание: SDS используется для диссоциации ферментов из плазмиды, полученные из-за воротами ферменты могут мешать реакции замещения цепи (рисунок 6). SDS рекомендуется здесь вместо тепловой денатурации ферментов, чтобы избежать диссоциации и рекомбинации неправильный ворот нитей, которые могут негативно повлиять на функцию цепи. [Пропустите этот шаг, для калибровки репортера.] Добавить присоединиться и вилки ворота (табл 13 и 14 по объемам)к синтетическому кварцевой кювете и перемешать раствор с помощью пипетки вверх и вниз, по крайней мере в 20 раз (не вихрь кювету, потому что встряхиванием решения с SDS может привести к пузырей, которые будут влиять на измерения кинетики флуоресценции). Кроме того, перейти на следующих шагов измерения как можно скорее, потому что реакция утечки инициирует сразу после добавления присоединиться и вилки ворот к синтетическим кварцевой кювете. Поместите синтетические кварцевые клеток в камере спектрофлуориметре. Начните измерение кинетики. Через 5 мин измерения, добавить входные нитей (табл 12, 13 и 14 для объемов) с синтетическим кварцевую кювету и перемешивают реакцию с помощью пипетки вверх и вниз, по крайней мере в 20 раз. Следует отметить, что образец следует смешать осторожно, чтобы избежать пузырьков. Выполните этот шаг, пока программа сбора данных приостанавливается, чтобы избежать измерения сигналов, вызванных внешнимилегкий. Запись кинетики реакции, пока не достигнет устойчивого состояния. Кинетика реакции отображаются на компьютере. 8. Калибровка Люминесцентные Журналисты Примечание: В этом разделе описывается протокол для принятия калибровочные кривые флуоресцентных журналистами. Калибровочные кривые будут использоваться для преобразования единиц флуоресценции произвольные концентрации молярной сигнала. Калибровка флуоресцентные журналистам следуя протоколу, описанному в 7. Использовать объемов реагентов и буферов, как приведены в таблице 12 Стандарт концентрация в данном примере составляет 50 нМ (1x). репортеры в 3x; вход 1x. Для случаев, когда вход <TC с> находятся на 0.25x, 0,5 × 0,75 раза, отрегулируйте громкость нуклеазы свободного H 2 O соответственно, чтобы сохранить конечный объем каждой реакции в 600 мкл. Пример данные показаны на фиг.7А. Сделать калибровочной кривой изReporter С помощью линейной подгонки значений флуоресценции конечных против исходной концентрации сигнала C (Пример калибровочной кривой показано на фиг.7В). Эта калибровка кривая может быть использован для преобразования произвольных единицах флуоресценции на соответствующий концентрации сигнала. 9. вычислить концентрацию плазмиды-производного ndsDNA Гейтс Примечание: каждый независимо обрабатываемый партию плазмид-разветвленного ndsDNA ворот приводит к различной мощности функциональных ворот, и в этом разделе описывается протокол для количественной оценки концентрации плазмид-разветвленного ndsDNA ворот. Количественная концентрации плазмиды, полученные ndsDNA ворот следуя протоколу, описанному в 7. Использовать объемов реагентов, как приведены в таблице 13. Примечание: В таблице 13 приведен пример рецепт Вилка до н.э. количественного Регистрация. </em> AB и другие ворота могут быть выполнены так же, но с использованием различных входных цепей, вспомогательные жилы и журналистам. Преобразование окончательное значение флуоресценции, измеренную в эксперименте, до концентрации сигнала C с использованием калибровочной кривой с шага 8.2. Потом обратно-расчета концентрации ворота ndsDNA. Например, конечное значение флуоресценции для ворот количественного эксперимента соответствует 25 нМ сигнала C (0,5 ×) на основе калибровочной кривой на фиг.7В. Поскольку запас Fork до н.э. разбавляют в 40 раз в этой реакции, концентрация запас ворот Вилка до н.э. составляет 1 мкм. 10. Кинетика измерения для реакции А + В-> B + C Примечание: В этом разделе описывается протокол для тестирования ДНК реализацию формального химической реакции с использованием флуоресцентных измерений кинетики. ЗаФорма кинетики измерений, следуя протоколу, описанному в Шаг 7. Использование объемов реагентов и буферов, как приведены в таблице 14.