الميكروية مزدوجة الماسورة والمركزة لقياس خارج الخلية ايون إشارات في أنسجة المخ
Summary
We demonstrate the fabrication, calibration and properties of two types of ion-selective microelectrodes (double-barreled and concentric) for measurement of ion concentrations in brain tissue. These are then used in the mouse hippocampal slice preparation to show that excitatory activity changes both extracellular potassium and sodium concentrations.
Abstract
Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular concentration of all major ions. As these ion shifts bear significant functional consequences, their quantitative determination is often required to understand the function and dysfunction of neural networks under physiological and pathophysiological conditions. In the present study, we demonstrate the fabrication and calibration of double-barreled ion-selective microelectrodes, which have proven to be excellent tools for such measurements in brain tissue. Moreover, so-called “concentric” ion-selective microelectrodes are also described, which, based on their different design, offer a far better temporal resolution of fast ion changes. We then show how these electrodes can be employed in acute brain slice preparations of the mouse hippocampus. Using double-barreled, potassium-selective microelectrodes, changes in the extracellular potassium concentration ([K+]o) in response to exogenous application of glutamate receptor agonists or during epileptiform activity are demonstrated. Furthermore, we illustrate the response characteristics of sodium-sensitive, double-barreled and concentric electrodes and compare their detection of changes in the extracellular sodium concentration ([Na+]o) evoked by bath or pressure application of drugs. These measurements show that while response amplitudes are similar, the concentric sodium microelectrodes display a superior signal-to-noise ratio and response time as compared to the double-barreled design. Generally, the demonstrated procedures will be easily transferable to measurement of other ions species, including pH or calcium, and will also be applicable to other preparations.
Introduction
Electrical signaling in the brain is based on the flux of ions across plasma membranes. Major ion movements into and from the extracellular space are not only mediated by passage through voltage-gated ion channels, but also by postsynaptic ionotropic receptors as well as ion transporters. Neuronal activity is thus accompanied by complex changes in the extracellular concentration of all major ions 1. For example, influx of sodium into neurons during excitatory activity has been shown to result in a decrease in the extracellular sodium concentration ([Na+]o) 2. The same holds true for the extracellular calcium concentration because calcium ions rapidly enter both pre- and postsynaptic structures 3. At the same time, potassium moves the opposite way and this mediates an increase in the extracellular potassium concentration ([K+]o) in the low mM range 4,5. Synaptic activity also causes changes in extracellular pH that are partly mitigated by concomitant glial membrane fluxes that change intraglial pH 6,7. These activity-related changes in extracellular ion concentrations have significant functional consequences. For example, even small increases in [K+]o depolarize neurons as well as glial cells thereby altering neuronal excitability, and several mechanisms exist to remove excess potassium 8. Failure of these may result in epileptiform activity of neurons or phenomena like spreading depression 1.
Because of their critical importance, quantitative determination of extracellular ion concentrations is often necessary and required to understand the function and dysfunction of neural networks under physiological and pathophysiological conditions. For decades, double-barreled ion-selective microelectrodes have proven to be excellent tools for such measurements in brain tissue 9. For many ions, highly specific sensors with low cross-reactivity for other ions are available. In addition to the classical double-barreled electrodes, so-called concentric electrodes were recently introduced. The latter provide a superior time resolution, but take a little more time and effort to construct 10.
In the following, we will describe the preparation and calibration of these two types of ion-selective microelectrodes. We then show how these electrodes can be employed in brain slice preparations for measurement of changes in [K+]o or [Na+]o induced by excitatory activity following different stimulation paradigms including bath and pressure application of drugs.
Protocol
Representative Results
Discussion
استنادا السائل الناقل، وقد استخدمت أقطاب ايون انتقائية بنجاح لعقود وبالنسبة للعديد من الأيونات، هي مجسات محددة للغاية المتاحة 22-26. عندما تستخدم في الفضاء خارج الخلية (ECS) الاستعدادات المخ الفقاريات، لا بد من أن نضع في اعتبارنا، بيد أن هذا هو أسلوب الغازية تماما: ففي حين أن عرض ECS هو فقط حوالي 20-50 نانومتر، وقطر أيون انتقائي الميكروية حوالي 1 ميكرون (أقطاب مزدوجة الماسورة) أو أكبر (أقطاب متحدة المركز). سوف نصائح من الميكروية ايون انتقائية تلف وبالتالي ليس فقط الأنسجة أثناء التطويق من الأنسجة، ولكن أيضا تكبير ECS، لصالح التقليل من العابرين أيون. على الرغم من هذه المزالق، العابرين أيون الخلية ردا على نشاط الخلايا العصبية متسقة بشكل ملحوظ بين مختلف المختبرات 7،8، مما يدل على مصداقية هذا الأسلوب.
أداء وملاءمة أقطاب ايون انتقائيةيعتمد على حساسيتها والانتقائية، والذي تم تعريفه من قبل كوكتيل الاستشعار ('السائل حامل الأيون غشاء') المستخدمة. الكوكتيلات استشعار تحتوي على جزيء الناقل خاص، على سبيل المثال valinomycin لK + الميكروية -selective الذي يسلك الانتقائية العالية للحصول على البوتاسيوم 27. بالرغم من ذلك، يمكن أن يحدث عبر التفاعل مع أيونات أخرى، ويجب أن يتم اختبار. Valinomycin يسلك عبر التفاعل الكبير لالأمونيوم، والتي لابد من أخذها في الاعتبار عند تفسير النتائج (على سبيل المثال 11،12). وعلاوة على ذلك، لأن الجهد للاستجابة للionophores تتبع سلوك Nernstian (راجع المعادلة 1)، ونسبة الإشارة إلى الضوضاء وعتبة الكشف تعتمد على تركيز أيون المراد قياسها. وهكذا، في حين صغير [K +] س العابرين تثير التغيرات الجهد كبيرة ضد خط الأساس منخفضة [K +] س، صغيرة [نا +] س العابرين هم أكثر صعوبة للكشف ضد مرحباخط الأساس GH [نا +] س (انظر الشكل 5 و 6).
يتم تحديد أداء أقطاب ايون انتقائية أيضا بقرار الزمني، الذي يخضع إلى حد كبير ثابت وقته الكهربائية. يتم تحديد هذا الأخير أساسا من قبل المقاومة المحوري من أجهزة الاستشعار، والسعة وزعت على طول ماصة، بين الحلول الداخلي والخارجي السائل. في تكوين مزدوج الماسورة، ومقاومة عالية، نظرا لعمود طويل من ردم استشعار أيون. لعازلة العازلة معين (في هذا البورسليكات الزجاج حالة)، ويخضع السعة من سمك العزل. في أقطاب مزدوجة الماسورة، وعرض عازل يصل إلى الجدار الزجاجي من ماصة. كما يخفف الزجاج بالقرب من الحافة، ويندرج عرض عازلة، وزيادة السعة. هذه العوامل تتضافر لإنتاج الأقطاب مع أوقات الاستجابة التي تتراوح من عدة مئات إلى عدة ميلي ثانيةثانية، وهذه العوامل هي متنوعة.
والميزة الرئيسية لتصميم متحدة المركز هي أن كلا من المقاومة المحوري والسعة إلى الحمام تتضاءل إلى حد كبير. ويحول ماصة متحدة معظم المقاومة للمبادل أيون ردم، ولم يتبق سوى بقايا في ميكرومتر القليلة الماضية قبل طرف. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الحل ملء داخل ماصة متحدة المركز ونأى جسديا من الحمام، مفصولة سمك جدارين الزجاج، والحد بشكل كبير من السعة. كما هو مبين في وقت سابق 10، التأثير المشترك لخفض المقاومة والسعة تحسنا في القرار الزماني لاثنين من حيث الحجم. في حالة متحدة المركز الكالسيوم 2+ ودرجة الحموضة الميكروية، وكانت أوقات الاستجابة 90٪ منخفضة تصل إلى 10-20 مللي ثانية 10. وهناك ميزة ذات الصلة لتصميم متحدة المركز هي أقل مستوى الضوضاء (راجع الشكل 8). نظرا لتقلص إلى حد كبير مقاومة، العابرين الجهد من أي أمبينيتم الحد من الضوضاء ر. وعلاوة على ذلك، التعافي من هذا العابرين سريعا، بسبب الوقت ثابت سريع. هذه التحف بالتالي فهي صغيرة وسريعة، ولها تأثير أقل التخريبية على التسجيلات الفسيولوجية (راجع الشكل 8).
هناك أيضا عيوب تقنية متحدة المركز. أولا، جمعيتهم هو أكثر تعقيدا، وتستغرق وقتا طويلا. والعيب الثاني هو الحاجة لوضع مسرى مكروي إشارة منفصلة مع طرفها، مما يستتبع استخدام إما micromanipulator منفصل أو مناور المزدوج المتخصصة. وأخيرا، الميكروية مزدوجة الماسورة يمكن أن تمتد إلى تصميم ثلاثي الماسورة، مما يسمح للكشف عن نوعين أيون مختلفة في نفس الوقت 28، وهو أمر غير ممكن لأقطاب متحدة المركز.
المزالق الأكثر شيوعا
silanization غير فعالة.
أهم خطوة، والعقبة الرئيسية في تلفيق أي-السيناتور السائلأو المستندة إلى أيون انتقائية مسرى مكروي هو الإجراء silanization. عندما تفشل الأقطاب الكهربائية على الاستجابة للتغيرات في تركيز أيون معين، أو الاستجابة مع استجابة الفرعية Nernstian (أي بشكل جيد أقل من 58 فولت لكل الفرق تركيز عشرة أضعاف)، فعالية سوء silanization هي عادة السبب. في تجربتنا، ويمكن أن يحدث هذا إذا رطوبة الجو مرتفعة جدا، أو منخفضة جدا، نموذجية من الشروط في ذروة فصل الصيف، أو الشتاء، على التوالي. إذا كان من الممكن لممارسة بعض السيطرة على غرفة الرطوبة، ويمكن التغلب على هذه المشاكل.
المقاومة القطب مرتفعة جدا.
إذا لزم الأمر، ومقاومة للبرميل حساسة أيون يمكن تخفيضه عن طريق شطف. تحقيقا لهذه الغاية، فضح طرفها لطائرة قوية من جلخ العالقة في الماء لبضع ثوان. وهذا سوف يسبب طرف أقصى درجات لكسر وانخفاض المقاومة إلى القيمة المطلوبة.
الجسور الملح.
ملحالجسور بين أيون والمرجعية برميل ينتج في أقطاب سيئة أو الاستجابة لا شيء، وبالتالي يمكن أيضا خلطا بين الأداء بشكل كبير في المعايرة. كما ذكر أعلاه (انظر النقطة 1.6.)، وهذا هو أساسا قضية عند اختيار مزدوجة الماسورة الزجاج ثيتا، بل هو نادر الحدوث عند استخدام الإزاحة، تقنية برميل الملتوية هو موضح هنا.
مع سهولة تلفيق في الاعتبار، وتصميم مزدوج الماسورة الأصلي لوكس 29 كثيرا ما يمكن استخدام مربح. يستخدم هذا الأسلوب قبل ملء أيون والمرجعية برميل مع حلول الملح، والتعرض السريع إلى حل سيلاني عن طريق الشفط والطرد من طرف، وبعد بواسطة إدماج ايون مبادل، أيضا عن طريق طرف (انظر 30،31) . يمكن أن تكون ملفقة هذه الأقطاب في ما يقرب من 10 دقيقة، ولكن حجم غيض من عادة 4 ميكرون أو أكثر وتكون أكثر عرضة للفشل أثناء التجربة. في المقابل، طرق silanization التي تنطوي على التعرض لبخار سيلاني والحرارةجي يمكن أن تنتج الأقطاب مع نصائح الأصغر التي تستمر يوما، وأحيانا أسابيع.
معا، وهناك العديد من بروتوكولات والنهج على كيفية إعداد الميكروية ايون انتقائية. هنا، التي وصفناها إجراءين الرئيسية لتصنيع الميكروية الماسورة المزدوج وكذلك متحدة المركز الملتوية التي تعمل بشكل جيد وموثوق بها في مختبراتنا، مع معدل النجاح العام ما يقرب من 100٪. الأهم من ذلك، فإن هذه التقنيات قابلة للتحويل إلى قياس أنواع الأيونات الأخرى، بما في ذلك درجة الحموضة أو الكالسيوم، وستكون تنطبق أيضا على الاستعدادات الأخرى من الدماغ، بما في ذلك تجاويف مملوءة بسائل أو السوائل بشكل عام. وأخيرا، وليس آخرا، الميكروية ايون انتقائية تسمح تحديد تركيزات الأيونات داخل الخلايا. بسبب حجمها نسبيا حجم غيض (~ 1 ميكرون)، هذه الإرادة، ومع ذلك، لن يكون ممكنا إلا في الخلايا مع خلايا الجسم كبير، على سبيل المثال مثل الموجودة في الاستعدادات اللافقارية 28،32.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب أود أن أشكر C. Roderigo للحصول على المساعدة الفنية للخبراء. نشكر S. كولر (مركز التصوير المتقدم، هاينريش هاينه جامعة دوسلدورف) للمساعدة في إنتاج الفيديو. وقد تم تمويل البحوث في مختبر البلاغ من قبل جمعية الألمانية للبحوث (DFG: رو 2327 / 8-1 لCRR)، وهاينريش هاينه جامعة دوسلدورف (لNH) وقبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01NS032123 (لMC).
Materials
| Abrasive | MicroPolish | Buehler GmbH | Dissolved in A.dest |
| Borosilicate-glass capillaries | 1405059 | Hilgenberg | Application pipette; 75 mm x 2 mm, wall thickness 0.3 mm |
| Borosilicate glass capillaries with filament | GC 150 F-15 | Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus | For the sensor of double-barreled microelectrodes |
| Borosilicate glass capillaries with filament | GC100-F-15 | Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus | For the reference of double-barreled microelectrodes |
| Borosilicate glass capillaries with filament | GB-200TF-15 | Science Products | Concentric, outer channel. o.d. 2.0 mm |
| Borosilicate glass capillaries with filament | GB-120TF-10 | Science Products | Concentric, inner channel. o.d. 1.2 mm |
| Digidata | 1322A | Axon Instruments | |
| Electrometer amplifier with headstage | Custom-made | Rin = 10TΩ and Ibias=50fA-1pA (commercially available alternatives: e. g. Dagan IX2-700, with headstage (10 Gig feedback resistor) or EPMS-07, NPI, Tamm, Germany) | |
| Experimental chamber | Custom-made | Commercially available from e.g. Warner Instruments,USA; Scientifica, UK | |
| Furnace | Heraeus | Must stay constant at 200°C | |
| Hard sticky wax / dental wax | Deiberit 502 | Siladent Dr. Boehme & Schoeps GmbH | |
| Hot plate | Custom-made | Must stay constant at 40°C | |
| Microelectrodes holder made of plexiglas | Custom-made | Double-barreled: o.d. capillaries 1.5 mm, concentric: o.d. capillaries 2 mm | |
| Micromanipulator | Leitz | ||
| Micromanipulator | MD4R | Leica | |
| Stereo microscope | M205C | Leica | |
| Objective | Plan 0.8xLWD | Leica | |
| Pipette puller | Model PP-830 | Narishige | Concentric microelectrodes |
| Pipette puller | Model P-97 | Sutter Instruments | Sensor of concentric microelectrodes |
| Pneumatic drug ejection system | Picospritzter Type II | General Valve TM Corporation | |
| Travel dovetail stage | DT 25/M | Thorlabs | |
| Two-component glue | Araldite | Huntsman advanced materials GmbH | One may also use a small stripe of aluminum foil to stick the capillaries together |
| Silverwire | 99.9% | Wieland Edelmetalle | |
| Slicer / Vibratome | Microm HM 650 V | Thermo Scientific | |
| Software | AxoScope 8.1 | Axon Instruments | |
| Vertical puller | Type PE-2 | Narishige Scientific Instruments | With a revolvable chuck for double-barreled microelectrodes |
| x/y translational stage | Custom-made | ||
| Name of Compound | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 1(S),9(R)-(−)-Bicuculline methiodide | Sigma aldrich | 14343 | Competitive antagonist of GABAA receptors (light-sensitive); CAUTION toxic |
| CNQX | Sigma aldrich | C-127 | AMPA/kainate receptor antagonist; CAUTION toxic |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma aldrich | D5879 | |
| DL-AP5 | Alfa Aesar | J64210 | NMDA receptor antagonist; CAUTION toxic |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma aldrich | 440191 | CAUTION: Flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) and corrosive to metals and skin |
| L-Aspartic acid | Sigma aldrich | A9256 | Activates NMDA and non-NMDA and EAATs |
| L-Glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma aldrich | G1626 | Activates NMDA-R, AMPA-R, QA-R and KA-R), mGluRs and EAATs |
| Potassium ionophore I – cocktail B | Fluka | 60403 | Based on valinomycin; CAUTION toxic |
| Sodium ionophore II – cocktail A | Fluka | 71178 | Based on ETH 157 |
| TTX | Ascent Scientific | Asc-055 | Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION toxic |
| Water, ultra pure | Sigma aldrich | W3500 |
Referências
- Somjen, G. G. Ion regulation in the brain: implications for pathophysiology. Neuroscientist. 8, 254-267 (2002).
- Dietzel, I., Heinemann, U., Hofmeier, G., Lux, H. D. Stimulus-induced changes in extracellular Na+ and Cl- concentration in relation to changes in the size of the extracellular space. Exp Brain Res. 46, 73-84 (1982).
- Nicholson, C., ten Bruggencate, G., Stockle, H., Steinberg, R. Calcium and potassium changes in extracellular microenvironment of cat cerebellar cortex. J Neurophysiol. 41, 1026-1039 (1978).
- Rice, M. E., Nicholson, C. Glutamate- and aspartate-induced extracellular potassium and calcium shifts and their relation to those of kainate, quisqualate and N-methyl-D-aspartate in the isolated turtle cerebellum. Neurociência. 38, 295-310 (1990).
- Prince, D. A., Lux, H. D., Neher, E. Measurement of extracellular potassium activity in cat cortex. Brain Res. 50, 489-495 (1973).
- Deitmer, J. W., Rose, C. R. pH regulation and proton signalling by glial cells. Prog Neurobiol. 48, 73-103 (1996).
- Chesler, M. Regulation and modulation of pH in the brain. Physiol Rev. 83, 1183-1221 (2003).
- Kofuji, P., Newman, E. . Regulation of potassium by glial cells in the central nervous system. , (2009).
- Nicholson, C. Ion-selective microelectrodes and diffusion measurements as tools to explore the brain cell microenvironment. J Neurosci Methods. 48, 199-213 (1993).
- Fedirko, N., Svichar, N., Chesler, M. Fabrication and use of high-speed, concentric h+- and Ca2+-selective microelectrodes suitable for in vitro extracellular recording. J Neurophysiol. 96, 919-924 (2006).
- Stephan, J., et al. Kir4.1 channels mediate a depolarization of hippocampal astrocytes under hyperammonemic conditions in situ. Glia. 60, 965-978 (2012).
- Haack, N., Rose, C. R., Lei, K. F. Preparation, Calibration and Application of Potassium-Selective Microelectrodes. Microelectrodes. , 87-105 (2014).
- Roos, A., Boron, W. F. Intracellular pH. Physiol Rev. 61, 296-434 (1981).
- Kleinhans, C., Kafitz, K. W., Rose, C. R. Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).
- Hertz, L., et al. Roles of astrocytic Na ,K -ATPase and glycogenolysis for K homeostasis in mammalian brain. J Neurosci Res. , (2014).
- Pumain, R., Heinemann, U. Stimulus- and amino acid-induced calcium and potassium changes in rat neocortex. J Neurophysiol. 53, 1-16 (1985).
- Vargova, L., Jendelova, P., Chvatal, A., Sykova, E. Glutamate, AMPA, NMDA Induced Changes in Extracellular Space Volume and Tortuosity in the Rat Spinal Cord. J Cereb Blood Flow Metab. 21, 1077-1089 (2001).
- Fellin, T., Gomez-Gonzalo, M., Gobbo, S., Carmignoto, G., Haydon, P. G. Astrocytic glutamate is not necessary for the generation of epileptiform neuronal activity in hippocampal slices. J Neurosci. 26, 9312-9322 (2006).
- Rouach, N., Koulakoff, A., Abudara, V., Willecke, K., Giaume, C. Astroglial metabolic networks sustain hippocampal synaptic transmission. Science. 322, 1551-1555 (2008).
- Lux, H. D., Heinemann, U., Dietzel, I. Ionic changes and alterations in the size of the extracellular space during epileptic activity. Adv Neurol. 44, 619-639 (1986).
- Zanotto, L., Heinemann, U. Aspartate and glutamate induced reductions in extracellular free calcium and sodium concentration in area CA1 of ‘in vitro’ hippocampal slices of rats. Neurosci Lett. 35, 79-84 (1983).
- Borrelli, M. J., Carlini, W. G., Dewey, W. C., Ransom, B. R. A simple method for making ion-selective microelectrodes suitable for intracellular recording in vertebrate cells. J Neurosci Methods. 15, 141-154 (1985).
- Ammann, D., Anker, P. Neutral carrier sodium ion-selective microelectrode for extracellular studies. Neurosci Lett. 57, 267-271 (1985).
- Deitmer, J. W., Schlue, W. R. Intracellular Na+ and Ca2+ in leech Retzius neurones during inhibition of the Na+-K+ pump. Pflugers Arch. 397, 195-201 (1983).
- Schwiening, C. J., Thomas, R. C. Relationship between intracellular calcium and its muffling measured by calcium iontophoresis in snail neurones. J Physiol. 491 (Pt 3), 621-633 (1996).
- Chesler, M., Kraig, R. P. Intracellular pH of astrocytes increases rapidly with cortical stimulation. Am J Physiol. 253, R666-R670 (1987).
- Ammann, D., Chao, P. S., Simon, W. Valinomycin-based K+ selective microelectrodes with low electrical membrane resistance. Neurosci Lett. 74, 221-226 (1987).
- Deitmer, J. W. Bicarbonate-dependent changes of intracellular sodium and pH in identified leech glial cells. Pflugers Arch. 420, 584-589 (1992).
- Lux, H. D. Fast recording ion specific microelectrodes: their use in pharmacological studies in the CNS. Neuropharmacology. 13, 509-517 (1974).
- Nicholson, C., Phillips, J. M. Ion diffusion modified by tortuosity and volume fraction in the extracellular microenvironment of the rat cerebellum. J Physiol. 321, 225-257 (1981).
- Chesler, M., Chan, C. Y. Stimulus-induced extracellular pH transients in the in vitro turtle cerebellum. Neurociência. 27, 941-948 (1988).
- Thomas, R. C. Intracellular sodium activity and the sodium pump in snail neurones. J Physiol. 220, 55-71 (1972).
