啮齿动物脑显微注射学习动机行为的分子基板

涉及受试动物的程序已被批准的机构动物护理和使用委员会（IACUC）在弗吉尼亚联邦大学，并坚持美国国立卫生研究院指南实验动物的护理和使用。 1.准备实现了手术前和显微注射建立了材料准备： 获得＆G套管管道，33克闭孔丝，33克显微注射针管，微量塑料管（PE20或等效物），两个中重直止血剂，实验室卷尺，直尺，永久标记，70％的乙醇（体积/体积），存储小瓶（例如，将20ml玻璃闪烁），超级胶，小称量皿，并且旋转工具配备有非重型截止光盘。 注：固定旋转工具来使用带或磁带枪头盒子是有帮助的，因为它提升了工具。戴眼睛的保护是使用旋转工具时避免损伤重要的。 附上一张实验室或高压灭菌带了替补席上。 准备插管的： 注：至少有两个套管需要每鼠的双侧注射。一个附加套管将在后面的步骤中使用。 获得足够的长度套管管道的部分，以避免标记和切割过程中的弯曲。 从用细尖笔1.1.2步上绘制带15毫米的基准线。这将作为对管连续15个毫米的部分，用锋利的永久性标记标记的导向。 触摸套管管道，在标记的点，到旋转工具的慢速纺丝截止光盘以缺口管材。旋转套管180˚和缺口管材的相对侧。不要通过管子完全切断，因为这可能会导致阻塞。 剧烈的弯曲管道，以便它分解成〜15毫米部分。 握住套管的各切端垂直于截止拇指和食指之间光盘。旋转套管管在触摸尖端截止盘（ 即不是边缘）的大前锋表面。这将生成一个钝尖。注意：不要弯曲套管，为可能产生的异地注射。 令与＆G斜口针（棕色毂）套管的两端，以确保所有的毛刺已被删除并且该套管是通畅。 通过闭孔线切割样品到〜35毫米的通切插管，以确认不存在任何内部障碍物。 拿起单独使用松开止血每个插管和衡量每完成插管用尺子来确保它的长度整整14毫米。 准备阻塞器的： 夹紧一个插管在大约半长与重量适中，直止血。躺在长椅上锁定的止血钳。套管应垂直于替补席。 注：此套管不应该被用在外科手术被保持由锁定止血后，因为它很可能弯曲。 订阅闭孔线的一端插入套管，直到它达到了替补席上。弹起丝在插管以确保毛刺不阻止它到达替补; 即 ，在到达套管的底部。正确的闭孔长度将防止堵塞和额外的组织疤痕。 弯曲的线用手指捏，直到同时保持闭孔和替补之间的接触〜30˚角来实现的。确保弯曲的角度是这样的，它规定与头帽齐平，和过量的面向前方，从而使其更难大鼠除去。 从套管中取出电线切断，在超出的部分约2.5毫米的小斜刀（线切割）的弯曲。 注意：至少有两个密闭装置将需要每只大鼠的双侧注射，因为每个植入插管需要一个插塞。创建通过闭孔额外〜35˚弯曲中途也将有助于防止去除动物。同时存储插管和含70％乙醇（体积/体积），直到使用在分开的小瓶中充填器（例如，20毫升玻璃闪烁），但至少O / N。 制备及microinjectors的测试： 获取一块微量注射器针管的是约1米长。 握住微量管的一端垂直地锁定直止血。 扭动止血，同时保持张力的油管紧紧线圈它周围的止血钳的至少一个时间。 测量从微量管的对面，宽松的端部32毫米，垂直地抓住这一点与连续第二个，中等重量止血并将其锁定。抓住微量管上的32毫米边止血标志最接近宽松的结束，而不是最接近止血一边用绕线。 本D中的管来回，同时保持紧张油管直至其断裂。 注意：一个单一的，尖锐的向上和向下的弯曲会产生一个钝断裂，这是所希望确保显微注射发​​生在期望的大脑区域。 检查微量管，以确保两端是直的并且其内径是通畅。 获得套管管道将被用于制造微量衣领。 测量并用永久性记号笔画和磁带上（步骤1.1.2）一个5毫米的基准线标记套管管连续5毫米部分。 注意：每个微量需要一个项圈。项圈是简单的短套管坚持以微量电线。 触摸套管管，在标志点，以旋转刀具的缓慢旋转切断盘，以缺口管材。旋转套管180˚和缺口管材的相对侧。切割完全可能堵塞管道。 一针见血弯曲微量领管，以它分解成〜5毫米部分。 铰用＆G斜口针（棕色毂）的套环的两端的内径，以确保大部分毛刺已被删除。一些小毛刺会抢了微量电线，从而有助于粘合。 1环滑动到每个微量管〜2厘米的结束。 小权衡船角落创建的强力胶一个小水池。 使用废料套管管道切成〜25毫米到涂抹少量强力胶到微量管〜5毫米，从一端。接着，滑动套环移到该超级胶水珠，以便它是从微注射管的端部〜1毫米。覆盖用胶水颈圈的两端。 注意：避免强力胶大量堆积在衣领上，因为它会阻止塑料管从周围的微量密封。虽然，以避免强力胶的微量管的开口端，因为这会令是很重要的的微量不可用，这也是很重要的滑动轴环尽可能靠近端，以尽量减少空隙（未注射）的体积。 精益完成的微量上的另一个小权衡与衣领的一面朝上船外，并晾干24小时。 得到〜8厘米一块微量的塑料管（PE20或等效物），1毫升注射器填充有无菌水，和＆G斜口针（棕色毂）。 附加26克（棕色集线器）针注射器滑动切管到针，确保不要刺破管。 滑动塑料管在干的，完全微量的衣领结束。 挤水填充针筒柱塞以测试通畅。 注：水宜喷很远又直出微量尖。如果流是不直，注射位置将不正确。横盘或弥漫性喷雾的来源是一个贫穷的突破（步骤1.4.5）。微量注射器不应该T表示，如果喷雾是横盘或弥漫性使用。盐水不应该被使用，因为它会阻塞微量或针。 为了从微量去除水中拉出注射器回来。应贮存在干燥，密封的小瓶;例如，一个20毫升玻璃闪烁瓶中。 注：Microinjectors可以制造与大多数超级胶水，31后进行高压灭菌，但是这必须根据经验来确定。替代灭菌技术包括环氧乙烷和γ照射。 2.准备和执行显微注射获得完成microinjectors，微量塑料管（PE20或等效物），显微注射泵，两个小称量皿，无菌水，70％的乙醇（体积/体积），丙酮，二气密1μl的玻璃注射器的钝针（25 G）的棉签木喷头，备用密闭装置，1ml注射器，26 G（棕色集线器）的针，小弯钳（款式＃7推荐），和实验室W¯¯IPES。 准备microinjectors注射： 弯曲完成微量注射器从相对的套环端15毫米，使两者之间的角度为〜95˚。 注：精确的弯曲位置是刻不容缓的准确注射位置。使用＃7镊子（或类似）抓住微量和弯曲向上是非常有用的。始终重新测量进行显微注射​​前的长度。 将塑料管（PE20）到〜70厘米，滑过微量衣领。 注意：添加磁带选项卡，其中的一个塑料筒近两个微量和适度宽松的结束完成注射时，注射两种不同的解决方案，特别是当是很有用的。标签不推荐用于管，因为他们成为在注射过程中繁琐。 准备泵显微注射： 电源开泵。 设置直径显微注射针的，所需的输注率，和目标注射量。 注意：输液鼠e和注射量取决于实验的要求。这是在讨论中阐述。有些泵有预装注射器表。如果不是这样，一个注射器表可以在制造网站（多个）中找到。 将泵模式为“音量”，这样一个精确的音量自动发送。如果选择“泵”模式，请实验者必须手动停泵。 调节泵逆止以允许注射器来填充到注射体积外加0.2微升。 准备显微注射的注射器和微量注射： 锁每个气密显微注射注射器插入微量注射泵的齿条。 放置气密注射器的尖端到包含在一个小的无菌水称重舟，轻轻扑柱塞以润滑内部导线。均匀地拉柱塞逆止泵，填补了水。 滑动PE20管材是合作nnected到微量（步骤2.2）在连接到一个1ml注射器填充有无菌水26克（棕色集线器）针。通过微量喷雾无菌水，并检查喷雾形状和距离。 注：水宜喷很远又直出微量尖。如果流是不直，注射位置将不正确。 将灭菌微量到无菌区。 滑动管道落针，保持微量管直立，以防止水滴落出来，同时也降低了由针受损区域的下方的管道。 推显微注射针筒柱塞稍微向前以创建在所述针的端部的液滴和滑动充水PE20管（被连接到微量）到针。 注：这将创建一个液 – 液连接，将允许适当的反压，可以赶走，可以形成以堵塞该微量的一角。 推动柱塞完全向前，以备样量，并确保没有一丝酒精留在微量。 通过触摸已经形成微量的尖端到一个干净的实验室擦拭多次水滴检查设置是否有泄漏。 注意：当接触到实验室擦拭，只有一个湿点应该形成。如果有更多的液滴，存在在系统中的泄漏。 通过控制超级胶水的应用程序（步骤1.4.14），并通过调整PE20管材用锋利的剪刀或刀片的PE20管从任何连接删除的任何时间，避免泄漏。此外，重复步骤2.4.3至2.4.8，以弥补泄漏。 拉注射器活塞回到0.2微升;创建无菌水在PE20管道/微量和溶液之间的气泡被注入。 注意：此气泡可防止稀释注射液中，水的污染，并允许用于监测注射过程的，因为它会在注射过程中移动。一个单一的，坚实的泡沫应该产生。如果它坏了，存在泄漏或微量尖闭塞;这表明步2.4.8（和附带的注释）应反复。 将在微量到试剂注入，然后慢慢将注射器柱塞，逆止器。 动物准备注射： 抓住老鼠的胸部对实验者的胸部。用棉涂敷器浸泡在70％的乙醇清洗围绕插管的区域（体积/体积）。 注意：使用适当的处理，老鼠可以轻轻地在杯形手的限制。否则，矿泉去油光可能需要。 删除使用小镊子和地方密闭装置进入称重舟用70％乙醇（体积/体积）。 执行注射： 将填充微量（步骤2.4.10）进入套管。按微量注射泵和监测气泡运动的开始。 注意：マŸ需要稍微用力，以确保microinjectors都不抬。泡沫（形成步骤2.4.9）应统一推进，全面进入微量。 除去从套管的microinjectors和替换密闭装置中，一旦注射完成和后喷射扩散周期已经过去。 注意：典型后喷射的扩散时间是2 – 4分钟药理试剂，和2 – 10分钟的病毒。留在微量在后输液期间防止注射液从回流备份插管，而不是扩散到组织中。在乙醇填充权衡船一侧放置密闭装置，使乙醇重新插入到插管前排水。 3.注射后清理获取一个小瓶的每一个：无菌水，70％乙醇和丙酮。 清洗微量注射器和显微注射针筒： 卸下玻璃注射器- 从玻璃注射泵的注射器架和注射管。 从玻璃注射器断开微量管和附加1ml注射器经由＆G针（棕色毂）充满无菌水到微量管中。按1毫升注射器活塞前锋驱逐-0.3毫升接下来，触摸微量的尖端实验室擦拭和拉风回通过微量。 注意：微量和管道可以被重新用于类似的实验，如果认为谨慎。 将玻璃注射器针头插入无菌水，并绘制活塞完全恢复。其次，推动柱塞完全向前冲。触摸玻璃注射器尖端实验室擦拭，以确保没有液体的存在。 用无菌水，空气，70％乙醇和丙酮按以下顺序重复步骤3.2.3：无菌水，无菌水，空气，空气，70％乙醇，70％乙醇，空气，空气，丙酮，丙酮，空气，空气。执行所有这些清洁步骤将有助于维护显微注射针筒。 放置微量注射器（S）为包装和拉柱塞回0.05微升。 注意：这是重要的，因为它允许在柱塞被推动或拉动，以便驱逐可能发生的应保存后的任何盐沉积物形成卡住柱塞。 4.编程动机测定登录到图形状态具有管理员凭据。 选择或创建相关的数据库。 创建渐进比强化程序： 选择列表>数据库级列表>事件转换参数列表。 选择“添加”。输入相应的列表号（L＃）和描述。 选择“添加事件”。 输入第一个强化程序的价值，并选择“添加”。重复。 注意：值可以通过使用其中渐进比时间表= 5E（j *（加强件挣得+ 1））-5一个公式确定7。为了调整此公式来正确测试该假说，值j必须凭经验确定，或从文献中获得。 内的“选择订单”框中选择“为了'。 选择“保持值=为：____”中的“完成时”框。输入加固进度值到远远超过预期的响应文本框。这将是所有后续项目所需的努力，一旦名单已经用完。 创建一个实验方案： 注意：图形状态移动通过一系列状态被退出基于时间或性能标准的受试者。设置如下标记为“$”下检查，以适当地测试假设所有离散和上下文线索和参数。 选择文件>新建实验方案。 输入所需的协议号和描述成相应的文本框中。 </l我> 选择“国家创作”。 和“FIN – 完成国家” – 同时为“就绪状态RDY”将所有的刺激。 选择“新的国家”，并命名为“S2 – PR响应。 选择“新的国家”，并命名为“S3 – PR增强剂和提示” 选择“新的国家”，并命名为“S4 – 超时”。 突出显示“S1”并将其命名为“S1 – 习惯化。” 选择添加“时间定位。” 输入适当的时间（$）和单位（$）， 例如 ，分钟，距离为s下拉框中选择“S2”。时间单位“单位”是最初创建数据库时确定的。 注：创建的过渡时间应改为类似于[之后$分钟GO P = 100％，到S2 图 1是曾经创造了这个事件的例子。 </ OL> 图1代表编程实例＃1中。在这种情况下一个时间分隔的状态示于其中$用户定义的值，在这里显示分钟，表示当目前的状态应退出到状态2（S2）。 突出“S2 – PR响应。 选择添加“活动回到”。 输入列表名称包含在步骤4.3创建到第一个文本框为L $（ 例如，L1）的渐进比时间表，选择合适的operandum（例如，杆或鼻子戳）的第一个下拉框，选择“ S3“从送下拉框中。 注：创建的事件可以读取类似[如果L $ 1 – 主动GO P = 100％，达到S3。标识符1 – 主动数据库创建时被指定。在这里，1 – 活动指的是插入到交换机的一个operandum。 选择“添加时间转到”。 检查“R”框中，输入适当的时间和单位（$），并从送选“FIN”下拉框中。 注：创建时间事件可以读取类似，[R（选中），如果$分钟GO P = 100％，达到FIN。这将确保该会议将结束，如果有在后的设定阈值operandum任何活动; 即会话将超时动物隐瞒的强化物配对operandum了设定的时间段响应后。 选择添加“活动回到”。 检查“R”框中，输入1到第一个文本框，选择适当的operandum从第一个下拉框中的释放，而从送下拉框中选择“S2”。 注：创建的事件可以读取类似，[R（检查）后$ [1]主动GO P = 100％，到S2。此步骤确保于operandum释放（方括号如上所述），这个状态重新进入，以此来重置会话超时阈值（4.4.9.4）。此时，状态将退出当包含在列表中的渐进比完成时（步骤4.4.9.2）或会话超时（步骤4.4.9.4）。因此，每当该operandum被激活时，它计数为逐步比。 ，而且，每次的operandum失活的时间; 如在杆被释放或鼻子戳退出，会话超时阈值（步骤4.4.9.4）复位图2表示编程“S2所有过渡-公关回应。 “ 图2.代表性的编程实例＃2。在这里，状态在以下两种条件退出。大号$是4.3步创建的渐进比时间表。经日程COMPLET离子，国家退出到状态3（S3）。注意，该标准不具有R，其允许日程表前进，而不是再次开始在每次重新进入这个状态。国家还可以经过“$”分离开来说明FIN。这是预定的超时阈值后，如果没有响应该窗口中发生的会话将终止。这将在讨论进一步的解释。最后，会话超时阈值后，每operandum释放复位。因此，“[1]”表示operandum释放'1'。 突出“S3 – PR增强剂和提示。” 选择“添加时间去' 输入适当的时间和单位从送下拉框中提供的增强剂（$），然后选择“S4”。 注：创建时间事件可以读取类似[之后$秒钟GO P = 100％，至S4。 突出“S4 – 超时。” <ol> 选择添加“时间转到' 输入适当的时间和单位仍然处于非活动状态（$）以下增强剂交付，并从送下拉框中选择“S2”。 注：创建时间事件可以读取类似[之后$秒钟GO P = 100％，到S2。状态'S4 – 超时'可以不需要所有设计。 选择解决国家。 注：此协议是现在就可以运行。