공포 성 대 세포질의 정량화<em> 살모넬라</em> 차동 투과성으로하여 기본 대 식세포에서
Summary
We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.
Abstract
세포 내 세균 병원체는 세포질 또는 전문 병원체 함유 액포 (PCVs)에 복제 할 수 있습니다. 세포질에 도달하기 위해, 시겔 flexneri 및 Francisella novicida 같은 박테리아는 phagosome의 파열을 유도 할 필요가있다. 대조적으로, 살모넬라 티피 무리 움 살모넬라 함유 액포 (SCV)라고도 액포 구획에 복제. 그러나 특정 살모넬라 돌연변이 SCV 무결성을 유지하는 데 실패함으로써 세포질로 방출된다. 세균의 하나의 레벨에 액포 박테리아 대 세포질의 비율은 phagosome 보호 분석법으로 알려진, 미분 투과성으로하여 측정 할 수있다. 접근 방식은 세제 디기 토닌의 재산의 사용이 선택적으로 콜레스테롤을 결합 할 수 있습니다. 세포막 다른 세포막 이상의 콜레스테롤을 포함하고 있으므로, 디기 토닌는 세포 막을 남기고 선택적으로 세포막을 Permeabilize 하시려면하는데 사용될 수있다그대로. 형광 마커 단백질 (예 중에서도 mCherry)를 발현하는 병원체 간략히, 다음의 감염, 숙주 세포의 세포막을 함유 디기 토닌 완충액으로 짧은 인큐베이션으로 투과성이있다. 세포를 세척하고 배양 한 다음 선택의 세균에 대해 유도 (원하는 형광 물질에 결합) 일차 항체 (예, 항 -FITC 살모넬라) 다시 세척한다. 도장이 박테리아가 사용되는 경우, 부가적인 단계가있는 모든 막을 투과 가능하며 모든 박테리아에는 해당 항체로 염색 할 수있다. 염색 후, 액포와 세균의 세포질 비율은 단일 또는 이중 양성 이벤트를 카운트하여 FACS 또는 현미경에 의해 정량화 될 수있다. 여기에서 우리는 박테리아 살모넬라 티피 무리 움이 기술의 사용을위한 실험적인 세부 사항을 제공합니다. 이 분석의 장점은 다른 분석 달리, 그것이 단일 bacte의 수준 정량을 제공한다는 것이다RIA, 현미경으로 분석 한 경우, 소정의 셀에서의 세포질과 액포 박테리아의 정확한 숫자를 제공한다.
Introduction
세균 세포 내 병원체를 직접 숙주 세포의 세포질 또는 전문 액포 구획 중 하나에 복제. 감염의 초기 단계에서 대부분의 병원균 (예 : 대 식세포) 또는 능동적으로 비 식세포로 자신의 흡수를 촉진하여 전문화 된 세포에 의한 식균 작용에 의해 내재화를 얻는다. 식세포에서 phagosome 정상적으로 포식 입자 소화 degradative 구획을 형성 리소좀과 융합한다. 이러한 Francisella novicida 또는 시겔 flexneri 같은 전문 세포질 박테리아는 phagosome의 파열을 유도하여 phagosomal 저하를 탈출 이후 세포질 2,3로 탈출. 이는 액포 파열 2-4을 촉진 이펙터 단백질을 주입 Francisella 병원성 섬 (FPI) 또는 시겔 flexneri T3SS, 같은 독성 관련 메커니즘을 필요로한다. 숙주 세포의 세포질 기능일반적 병원체의 존재를 인식하고 5 시그널링 선천성 면역을 유도 보존 패턴 인식 수용체의 수. 또한 xenophagy, 자식 작용의 항균 형태 세포질을 입력 세균을 저하 할 수있다. 박테리아 세포질 통상 잘 무딘 또는 다른 전략을 사용하여이 반응을 회피하도록 구성되어있다. 예를 들어, Francisella 호스트 인식을 피하기 위해 LPS를 수정하고 시겔은 분비 이펙터 단백질 6,7를 사용하여 자식 작용 모집을 방지 할 수 있습니다.
리소좀 저하를 탈출하는 또 다른 전략 모델 액포 병원체 살모넬라 엔테 혈청 형 티피 뮤 리움에 의해 고용되어, 그 후 살모넬라 티피 무리 움라고도합니다. 살모넬라 균은 세포 내 틈새 시장에 초기 phagosome 개조 이펙터를 주입하는 T3SS를 사용, 살모넬라 공포 (SCV) 함유 8,9. 호스트 경로의 연속 조작이다필요는 공포에 지질 및 기타 영양소를 보충하여이 공포를 유지합니다. 실제로, 살모넬라 SIFA 돌연변이 액포 안정성을 유지하는 데 실패하고 선천성 면역 경로와 자식 작용 모집 (8)의 활성화를 초래 감염 후 시간 이내에 숙주 세포의 세포질을 입력한다. 살모넬라 공포 성 탈출 연구하다 세포 유형에 따라 다양하고, 여러 가지보고 상피 세포에서도 WT 살모넬라 세포질 10 SCV 및 hyperreplicate 벗어날 수 있다는 것을 보여 주었다. 최근 보고서는 액포 병원균의 선천성 면역 검출도 인식하고 병원체 함유 액포 (PCVs) 11 ~ 14를 불안정하게 할 수있는 호스트의 능력에 달려 있음을 보여준다.
호스트 또는 박테리아 모두 유전자형 액포와 세포질 구획 사이의 세포 내 박테리아의 분포에 영향을 미칠 수 있음을 감안할 때, 그것은 액포 대들의 수를 정량화하는 것이 필요하다세포질 박테리아. , 이후 가장 실험 셋업에서 숙주 세포는 다른 세포 내 구획에서 여러 박테리아를 가질수이어서 하나 이상의 박테리아로 감염되고, 기술은 단일 박테리아의 수준을 정량화 허용하는 필요하다. (또한 phagosomal 보호 분석라고도 함) 차동 투과성으로는이 해상도 2,4,10,12를 제공합니다. 분석은 그대로 액포 막 잎 세제 디기 토닌와 숙주 세포 혈장 막의 선택적 투과성으로 기반으로하며, 따라서 항체의 선택적 박테리아 세포질 염색을 허용한다. 여기에서 우리는 차동 투과성으로를 사용하여 세포질과 액포 살모넬라 균의 정량이 프로토콜을 제공합니다. 이 방법의 원리는 그림 1에 설명되어 있습니다 : 골수 유래 대 식세포 (BMDMs)은 정지상이 살모넬라 균을 mCherry 발현에 감염된다. 고정상 살모넬라 균은 T가 필요그들이 활성 그렇지 NLRC4의 inflammasome을 인식하고 BMDMs 15의 신속한 세포 사멸 (pyroptosis)를 유도 할 것이다 T3SS SPI-1의 발현을 하향 조절하기 때문에 O 사용될. 세포를 세척하고 1 분간의 디기 토닌를 50㎍ / ㎖로 처리하여 감염에 이어. 세포를 다시 세척하고, 즉시 세포질에 접근 박테리아 마크 FITC 결합 항 살모넬라 항체와 함께 배양한다. 단계의 세포가 용해되어 추가 세척 및 mCherry + (액포)과 FITC + / mCherry + (세포질) 박테리아의 비율 후 FACS에 의해 결정된다. 우리는 또한 더 형광 단백질 발현 균주를 사용할 수는 (그림 2)없는 경우에 사용할 수있는이 방법의 적응을보고합니다. 추가 단계는 세포 투과성이 완전히 고정되는 FITC 표지 후에 도입된다. 그 후 모든 박테리아는 항 살모넬라 항체 및 해당 이차 항체로 염색된다. DETection은 다음 대신 FACS 분석의 현미경으로 이루어집니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
차동 투과성으로 분석하고 액포 구획과 세포질 사이의 세균성 병원균의 세포 내 분포를 정량화 할 수있는 쉽고 강력한 방법입니다. 같은 분석은 Francisella novicida 2,4와 시겔 flexneri (12) 박테리아에 성공적으로 사용되어왔다. 많은 세포 내 병원체 변경하거나 호스트 endomembrane 구조를 수정하기 때문에, 디기 토닌의 투과성으로의 견고성은 개별적으로 결정되어야 할 것이…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 토론 마티아스 S. 딕, 롤랜드 F. DREIER과 세바스찬 RUHL을 인정하고 싶습니다. 이 작품은 SNSF 교수 PP00P3_139120 / 1 PB에 대학 바젤의 프로젝트 보조금 ID2153162에 의해 지원되었다
Materials
| Digitonin | Sigma | D5628 | 50ug/mL |
| PFA | mpbio | 219998380 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630 | |
| Potassium Acetate | Sigma | 791733 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| anti-Salmonella CSA-1-FITC | KPL | 01-91-99-MG | 1/500 |
| anti-Salmonella CSA-1 | KPL | 02-91-99-MG | 1/500 |
| anti-Calnexin | Enzo Lifesciences | SPA-860D | 1/100 |
| anti-PDI | Enzo Lifesciences | SPA-890 | 1/100 |
| Saponin | Sigma | 47036 | |
| Vectashield mounting medium | Vectorlabs | H-1200 | |
| Anti Rabbit antibody-488 | Molecular Probes | A-11070 | 1/500 |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15710-49 | 100ug/mL and 10ug/mL |
| Triton X-100 | Promega | H5141 | |
| PBS | Gibco | 20012-019 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| NEAA | Amimed | 5-13K00-H | |
| LSM700 Confocal microscope | Zeiss | imaging done at 63x | |
| FACS Fortessa | BD technologies | detection mCherry 610 nm | |
| FACS Fortessa | BD technologies | detection FITC 530 nm |
Referências
- Kumar, Y., Valdivia, R. H. Leading a sheltered life: intracellular pathogens and maintenance of vacuolar compartments. Cell Host Microbe. 5, 593-601 (2009).
- Chong, A., et al. The early phagosomal stage of Francisella tularensis determines optimal phagosomal escape and Francisella pathogenicity island protein expression. Infect Immun. 76, 5488-5499 (2008).
- Mellouk, N., et al. Shigella subverts the host recycling compartment to rupture its vacuole. Cell Host Microbe. 16, 517-530 (2014).
- Checroun, C., Wehrly, T. D., Fischer, E. R., Hayes, S. F., Celli, J. Autophagy-mediated reentry of Francisella tularensis into the endocytic compartment after cytoplasmic replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 14578-14583 (2006).
- Broz, P., Monack, D. M. Newly described pattern recognition receptors team up against intracellular pathogens. Nat Rev Immunol. 13, 551-565 (2013).
- Hagar, J. A., Powell, D. A., Aachoui, Y., Ernst, R. K., Miao, E. A. Cytoplasmic LPS activates caspase-11: implications in TLR4-independent endotoxic shock. Science. 341, 1250-1253 (2013).
- Ogawa, M., et al. Escape of intracellular Shigella from autophagy. Science. 307, 727-731 (2005).
- Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. Salmonellae interplay with host cells. Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).
- Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole. J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).
- Malik-Kale, P., Winfree, S., Steele-Mortimer, O. The bimodal lifestyle of intracellular Salmonella in epithelial cells: replication in the cytosol obscures defects in vacuolar replication. PLoS One. 7, e38732 (2012).
- Zhao, Y. O., Khaminets, A., Hunn, J. P., Howard, J. C. Disruption of the Toxoplasma gondii parasitophorous vacuole by IFNgamma-inducible immunity-related GTPases (IRG proteins) triggers necrotic cell death. PLoS Pathog. 5, e1000288 (2009).
- Meunier, E., et al. Caspase-11 activation requires lysis of pathogen-containing vacuoles by IFN-induced GTPases. Nature. 509, 366-370 (2014).
- Yamamoto, M., et al. A cluster of interferon-gamma-inducible p65 GTPases plays a critical role in host defense against Toxoplasma gondii. Immunity. 37, 302-313 (2012).
- Degrandi, D., et al. Murine guanylate binding protein 2 (mGBP2) controls Toxoplasma gondii replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 294-299 (2013).
- Mariathasan, S., et al. Differential activation of the inflammasome by caspase-1 adaptors ASC and Ipaf. Nature. 430, 213-218 (2004).
- Knodler, L. A., Nair, V., Steele-Mortimer, O. Quantitative assessment of cytosolic Salmonella in epithelial cells. PLoS One. 9, e84681 (2014).
- Ng, H., Smith, D. J., Nagley, P. Application of flow cytometry to determine differential redistribution of cytochrome c and Smac/DIABLO from mitochondria during cell death signaling. PLoS One. 7, e42298 (2012).
- Krawczyk, E., Suprynowicz, F. A., Sudarshan, S. R., Schlegel, R. Membrane orientation of the human papillomavirus type 16 E5 oncoprotein. J Virol. 84, 1696-1703 (2010).
- Keller, C., et al. Single cell measurements of vacuolar rupture caused by intracellular pathogens. J Vis Exp. , e50116 (2013).
