液胞対細胞質の定量化<em>サルモネラ</em>差動透過化初代マクロファージで
Summary
We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.
Abstract
細胞内細菌性病原体は、細胞質ゾル中または特殊な病原体含有液胞（のPCV）で複製することができます。細胞質ゾルに到達するには、 フレクスナー赤痢菌とフランシセラnovicidaなどの細菌は、ファゴソームの破壊を誘導する必要があります。これとは対照的に、 ネズミチフス菌はサルモネラ含有液胞（SCV）として知られている液胞コンパートメントに複製されます。しかし、 サルモネラ菌の特定の変異体は、SCVの完全性を維持することができないので、細胞質ゾル中に放出されます。単一の細菌のレベルで液胞細菌対細胞質ゾルの割合は、ファゴソーム保護アッセイとして知られている、差動透過化することによって測定することができます。アプローチは、選択的にコレステロールを結合するための洗剤ジギトニンの性質を利用しています。細胞膜は、他の細胞膜よりもコレステロールを含んでいるので、ジギトニンが細胞内膜を残して選択的に細胞膜を透過するのに使用することができます無傷。簡潔には、蛍光マーカータンパク質（ 例えば mCherryをとりわけ）を発現する病原体による感染後、宿主細胞の原形質膜は、緩衝液を含むジギトニンで短いインキュベーションで透過されます。次いで、細胞を洗浄し、培養し、任意の細菌に対して向け（お好みの蛍光団に結合された）一次抗体（ 例えば抗サルモネラ -FITC）し、再び洗浄します。マークされていない細菌が使用される場合、追加のステップがあるすべての膜を透過処理され、すべての細菌は、対応する抗体で染色し、実施することができます。染色後、液胞および細胞質細菌の割合は、単一または二重陽性事象をカウントすることによって、FACSまたは顕微鏡により定量することができます。ここでは、菌、ネズミチフス菌でこの技術を使用するための実験の詳細を提供します。このアッセイの利点は、他のアッセイとは対照的に、それは、単一bacteのレベルで定量化を提供することですRIA、顕微鏡で分析した場合に、所定の細胞における細胞質ゾルおよび液胞細菌の正確な数を提供します。
Introduction
細胞内細菌性病原体は、直接宿主細胞サイトゾル中、または特殊な液胞コンパートメント1のいずれかで複製します。感染の初期段階では、ほとんどの病原体は、（マクロファージなど）、または積極的に非食細胞に自分の取り込みを促進することにより、特殊化した細胞による食作用によっていずれかを内在化を受けます。食細胞は、ファゴソームは、通常、貪食粒子が消化される分解室を形成し、リソソームと融合します。このようなフランシセラnovicidaや赤痢菌などの専門サイトゾル細菌は、ファゴソームの破壊を誘導することにより、ファゴソームの劣化を脱出し、続いて細胞質ゾル2,3に逃げ込みます。これは、液胞破裂2-4を促進するエフェクタータンパク質を注入フランシセラ病原性アイランド（FPI）またはフレクスナー赤痢菌 T3SS、などの病原性に関連するメカニズムが必要です。宿主細胞の細胞質ゾルの機能通常、病原体の存在を認識し、5シグナリング自然免疫を誘導する保存されたパターン認識受容体の数。また、xenophagy、オートファジーの抗菌フォームは、細胞質ゾルに入る細菌を分解することができます。細胞質細菌は、通常、十分に平滑または異なる戦略を使用してこれらの応答を回避するように適合されています。例えば、 フランシセラ、ホスト認識を回避するために、そのLPSを変更し、 赤痢菌が分泌エフェクタータンパク質6,7を使用して、オートファジーの動員を防止します。
リソソーム分解をエスケープする別の戦略は、その後、 ネズミチフス菌と呼ばれるモデル液胞病原体サルモネラエンテリカ血清型のネズミチフス菌によって採用されている。 サルモネラ菌はサルモネラ含有液胞（SCV）、その細胞内ニッチに初期ファゴソームを改造エフェクターを注入するT3SSを使用しています8,9。ホスト経路の連続的な操作であります液胞に脂質および他の栄養素を補充することによって、この空胞を維持するために必要。実際、 サルモネラのSIFA変異体は液胞の安定性を維持するために失敗し、先天性免疫経路とオートファジーの動員8の活性化をもたらす感染後時間以内に宿主細胞の細胞質ゾルに入ります。 サルモネラの液胞エスケープ研究である細胞型に依存して変化し、いくつかの報告は、上皮細胞においてさえWT サルモネラ細胞質10にSCVとhyperreplicateを逃れることができることを示しています。最近の報告では、液胞の病原体の自然免疫検出はまた、認識し、病原体含有液胞（のPCV）11-14を不安定化するホストの能力に依存することを示しています。
ホストまたは細菌の遺伝子型の両方が液胞および細胞質コンパートメント間の細胞内細菌の分布に影響を与えることができることを考えると、それは液胞対の数を定量化することが必要ですサイトゾル細菌。以来、ほとんどの実験的な設定で、宿主細胞は、異なる細胞内区画内の複数の細菌を保有することができ、その後、複数の細菌に感染され、この技術は、単一の細菌のレベルで定量化を可能にすることが必要とされます。 （また、ファゴソーム保護アッセイとして知られている）は、差動透過性は、この解像度2,4,10,12を提供します。アッセイは、無傷の液胞の膜を残す洗剤ジギトニン、を有する宿主細胞の原形質膜の選択的透過性に基づいており、したがって、抗体と細胞質の細菌の選択的染色を可能にします。ここでは、差動透過性を使用して、サイトゾルおよび液胞ネズミチフス菌の定量化のための2つのプロトコルを提供します。この方法の原理を図1に記載されている：骨髄由来マクロファージ（BMDMs）は固定相mCherryを発現サルモネラ菌に感染しています。固定相サルモネラトンを必要とします彼らは活動さもなければNLRC4のソームによって認識され、BMDMs 15の急速な細胞死（pyroptosis）を誘発することになるSPI-1 T3SSの発現をダウンレギュレートするため、O使用すること。続いて感染細胞を洗浄し、1分間ジギトニンを50μg/ mlので処理します。細胞を直ちに再び洗浄し、細胞質ゾルへのアクセスを、細菌をマークするためにFITCに結 合された抗サルモネラ抗体と共にインキュベートします。追加の洗浄工程の細胞を溶解しそしてmCherryを+（液胞型）およびFITC + / mCherryを+（サイトゾル）細菌の割合をFACSによって決定された後。また、何の蛍光タンパク質を発現する株は（ 図2）が利用できない場合に使用することができるこの方法の適応を報告しています。追加の手順は、細胞を固定し、完全に透過処理されたFITC標識後に導入されています。その後、全ての細菌は、抗サルモネラ抗体および対応する二次抗体で染色します。 DETectionは、代わりにFACS解析の顕微鏡検査によって行われます。
Protocol
Representative Results
Discussion
差動透過性は、液胞コンパートメントと細胞質ゾルの間の細菌性病原体の細胞内分布を分析し、定量化するための簡単かつ堅牢な方法です。同じアッセイは、 フランシセラnovicida 2,4および赤痢菌 12のような細菌で正常に使用されています。多くの細胞内病原体が宿主細胞内膜構造を変更したり、変更するので、ジギトニン透過化の堅牢性は、個別に決定す?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、議論のためのマティアス·S.ディック、ローランドF.ドライアとセバスチャンリュールを承認したいと思います。この作品は、PBにSNSF教授職PP00P3_139120 / 1と大学バーゼルのプロジェクトグラントID2153162によってサポートされていました
Materials
| Digitonin | Sigma | D5628 | 50ug/mL |
| PFA | mpbio | 219998380 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630 | |
| Potassium Acetate | Sigma | 791733 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| anti-Salmonella CSA-1-FITC | KPL | 01-91-99-MG | 1/500 |
| anti-Salmonella CSA-1 | KPL | 02-91-99-MG | 1/500 |
| anti-Calnexin | Enzo Lifesciences | SPA-860D | 1/100 |
| anti-PDI | Enzo Lifesciences | SPA-890 | 1/100 |
| Saponin | Sigma | 47036 | |
| Vectashield mounting medium | Vectorlabs | H-1200 | |
| Anti Rabbit antibody-488 | Molecular Probes | A-11070 | 1/500 |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15710-49 | 100ug/mL and 10ug/mL |
| Triton X-100 | Promega | H5141 | |
| PBS | Gibco | 20012-019 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| NEAA | Amimed | 5-13K00-H | |
| LSM700 Confocal microscope | Zeiss | imaging done at 63x | |
| FACS Fortessa | BD technologies | detection mCherry 610 nm | |
| FACS Fortessa | BD technologies | detection FITC 530 nm |
Referências
- Kumar, Y., Valdivia, R. H. Leading a sheltered life: intracellular pathogens and maintenance of vacuolar compartments. Cell Host Microbe. 5, 593-601 (2009).
- Chong, A., et al. The early phagosomal stage of Francisella tularensis determines optimal phagosomal escape and Francisella pathogenicity island protein expression. Infect Immun. 76, 5488-5499 (2008).
- Mellouk, N., et al. Shigella subverts the host recycling compartment to rupture its vacuole. Cell Host Microbe. 16, 517-530 (2014).
- Checroun, C., Wehrly, T. D., Fischer, E. R., Hayes, S. F., Celli, J. Autophagy-mediated reentry of Francisella tularensis into the endocytic compartment after cytoplasmic replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 14578-14583 (2006).
- Broz, P., Monack, D. M. Newly described pattern recognition receptors team up against intracellular pathogens. Nat Rev Immunol. 13, 551-565 (2013).
- Hagar, J. A., Powell, D. A., Aachoui, Y., Ernst, R. K., Miao, E. A. Cytoplasmic LPS activates caspase-11: implications in TLR4-independent endotoxic shock. Science. 341, 1250-1253 (2013).
- Ogawa, M., et al. Escape of intracellular Shigella from autophagy. Science. 307, 727-731 (2005).
- Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. Salmonellae interplay with host cells. Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).
- Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole. J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).
- Malik-Kale, P., Winfree, S., Steele-Mortimer, O. The bimodal lifestyle of intracellular Salmonella in epithelial cells: replication in the cytosol obscures defects in vacuolar replication. PLoS One. 7, e38732 (2012).
- Zhao, Y. O., Khaminets, A., Hunn, J. P., Howard, J. C. Disruption of the Toxoplasma gondii parasitophorous vacuole by IFNgamma-inducible immunity-related GTPases (IRG proteins) triggers necrotic cell death. PLoS Pathog. 5, e1000288 (2009).
- Meunier, E., et al. Caspase-11 activation requires lysis of pathogen-containing vacuoles by IFN-induced GTPases. Nature. 509, 366-370 (2014).
- Yamamoto, M., et al. A cluster of interferon-gamma-inducible p65 GTPases plays a critical role in host defense against Toxoplasma gondii. Immunity. 37, 302-313 (2012).
- Degrandi, D., et al. Murine guanylate binding protein 2 (mGBP2) controls Toxoplasma gondii replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 294-299 (2013).
- Mariathasan, S., et al. Differential activation of the inflammasome by caspase-1 adaptors ASC and Ipaf. Nature. 430, 213-218 (2004).
- Knodler, L. A., Nair, V., Steele-Mortimer, O. Quantitative assessment of cytosolic Salmonella in epithelial cells. PLoS One. 9, e84681 (2014).
- Ng, H., Smith, D. J., Nagley, P. Application of flow cytometry to determine differential redistribution of cytochrome c and Smac/DIABLO from mitochondria during cell death signaling. PLoS One. 7, e42298 (2012).
- Krawczyk, E., Suprynowicz, F. A., Sudarshan, S. R., Schlegel, R. Membrane orientation of the human papillomavirus type 16 E5 oncoprotein. J Virol. 84, 1696-1703 (2010).
- Keller, C., et al. Single cell measurements of vacuolar rupture caused by intracellular pathogens. J Vis Exp. , e50116 (2013).
