Zebra balığı Embriyo microbead İmplantasyonu

Bu protokol açıklanan Zebra balığı embriyolarının ile çalışmak için prosedürler Notre Dame Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. 1. Ringer Solüsyonu Hazırlama Herhangi bir tuz çökelmesini önlemek için sürekli karıştırma ile, aşırı saf, H2O ile 116 mM NaCI, 2.9 mM KCI, 3.6 mM CaCl2, 5 mM Hepes ihtiva eden bir çözelti yapmak. Tuzları, ekleme ve çözelti hala karıştırma sırasında sonra, 100 birim / mL başına penisilin ve ml başına 100 ug streptomisin ilave edin. Tüm antibiyotik ve bunların tuzlarını ilave edildikten sonra, steril bir kap içinde çözelti ve mağaza filtre sterilizasyonu gerçekleştirin. Not: N-feniltiyoüre (1-fenil-2-tioüre) ya da PTU embriyo sağlığına olumsuz sonuçlar doğurmadan kordon implante edilen embriyoların pigment oluşumunu engellemek için bir Ringer çözeltisine ilave edilebilir. Ringer / pigmentasyon bloke çözeltisinin hazırlanması için, konsantre ve kullanımı% 0.003 PTU trasyon. Nedeniyle PTU düşük konsantrasyona PTU tozun küçük miktarlarda eklenmesi önlemek için, Ringer çözeltisi daha büyük bir birim, en az 1 L yapılması tavsiye edilir eklenmelidir. Çözelti karıştırma sırasında, Aşama 1.2 sırasında PTU ekleyin. 2. Tricaine Çözelti Hazırlanması 9.5 arasında bir pH değerine, dengeli bir 1 M stoktan, çözeltisi artı 0.1 M Tris her bir L başına Etil 3-aminobenzoat metansülfonat tuzu (Tricaine) 2 g ekleyin ve ultra saf H2O ile yapılan Not: Tricaine boncuk implantasyon fenotipleri tahlil istenen bir zaman noktasında zebrabalıkları embriyolar ötenazi için kullanılacaktır. 3. E3 Çözüm Hazırlığı E3 1 L oluşturmak için, 0.25 M NaCI, 10 mM KCI, 12.5 mM CaCI2 ve 16.6 mM MgSO 4 ultra saf su L 1 bir çözelti yapmak. Mantar gelişimini inhibe etmek için, E3 çözeltisine Metilen Mavisi 200 ul ekle. Microbead Transferi 4. Çekme İğneler Bir OD filament ile ateş cilalı borosilikat cam kullanın: 1,0 mm, ID: 0.5 mm, 10 cm uzunluğunda. İnce iğne hazırlamak için Mikropipet çektirmenin içine borosilicated cam yerleştirin. Not: = 245, Velocity = 200 ve Zaman = 125 çekin, Isı = 540: Aşağıdaki dört boyut iğne çekmek için bir başlangıç ​​noktası olarak kullanılabilir. Iğne yeterli sayıda çekerek sonra, kapalı plastik mağaza kullanıma kadar, modelleme kil veya iğne ucu kırılma önlemek için yapışkan bant şeritler üzerinde konumlandırılmış yemekler, petri. İstediğiniz delik boyutuna iğne ucu kırpmak için, iğnenin ucunu puan ince forseps bir çift kullanın. Not: İğne delik boyutu microbead boyutu kullanılan yanı sıra kullanıcı taşıma tercihleri ​​ediliyor bağlı olarak değişecektir. 50-100 um arasında değişen mikro-kullanılacak olması durumunda iyi bir başlangıç ​​noktası 100 ve 200 um arasında bir aralıkta zanaat motorunun boyutları etmektir. Prior tamamlanan microbead transferi enstrüman moda kılcal boru tutucu içine kesilmiş iğneyi kullanmak. 5. Bıyık / Kirpik Aracı Hazırlama Bir bıyık edinin kirpik ya da doğal ya da sentetik saç filamanın diğer küçük ama sağlam bir parça. 45 ° 'lik açıyla filamanın üssü yakınlarında kesti. Kalıcı net yapıştırıcı tutkal kullanarak, bir P-1000 mikropipet ucu bıyık uyun. 6. microbead İmplantasyonu Tepsi Hazırlık E3 çözeltisi, 100 ml% 2'lik bir E3 agaroz jeli yapmak için olan agaroz 2 g karıştırın. Içinde köpüren jelin önlemek amacıyla şişeye her 30 saniyede bir dönen, 250 ml'lik bir Erlenmeyer şişesi içinde 1 dakika ve 30 saniye süreyle% 2 agaroz çözeltisi ısıtın. 60 mm x 15 mm petri kapağını alın ve yukarı bakacak iç ile daha büyük, 150 mm x 15 mm çanak yerleştirin. Aşağı demirlemek için emin olun, 150 mm x 15 mm petri içine sıcak agaroz jel dökünişaret parmağı ile küçük çanak kapağı. Not: jel dökerken oluşturacak yoğunlaşma kaldırmak için küçük çanak kapağın altında agaroz ince bir tabaka izin ver; Bu bir diseksiyon mikroskop altında görmek için boncuk daha kolay hale getirecek. Agaroz soğurken katılaşır önce ama, jel üzerinde iyi kalıp yerleştirin. Bu embriyo kolay yerleştirilmesi için izin verir. Not: Bu jel üstünde yüzen kadar kuyularda kabarcıklarını önlemek için, bir açı ile yavaşça kalıp yerleştirin. Jel katılaşmış bir kez microspatula kullanarak, dikkatle de kalıp çıkarmak. 4 ° C'de E3 solüsyonu ve mağaza ekleyin. 7. Embriyo Koleksiyon Sistem su ile dolduruyor ve daha sonra odalarına O / N yetişkin zebrabalıkları erkek (ler) ve dişi (lar) çiftleri koyarak, bölücüler ile ayrılmış çiftleşme odaları, hazırlayın. Bir ince tel örgü süzgeç kullanarak döllenmiş yumurta toplamak (embriyonik aşamaları biraz değişecektir). Orada çanak E3 çözeltisi yaklaşık 25 ml süzgeç bırakılan yumurta kalmayana dek ters süzgeç tornalama ve E3 ince bir akımı ile durulanarak, temiz, 10 cm çapında bir Petri tabağına döllenmiş yumurta bırakır ve. Toplandıktan sonra, debriyaj içinde gelişim asenkroni yol ve zor istenilen kat puan toplayarak hale getirebileceğini aşırı kalabalık önlemek için çeşitli yemekler (tabak başına yaklaşık 50-60 yumurta) içine yumurta bölmek. Standart zebrabalıkları evreleme serisi 40 göre gelişimsel değerlendirme etkinleştirmek için 28.5 ° C'de E3 çözeltisi içinde embriyolar kuluçkaya yatmaktadır. Not: embriyolar eski aşamalarında manipülasyonlar optik netlik gerektiren eğer pigment gelişimini önlemek için 24 saat sonrası fertilizasyon (hpf) E3 / PTU transfer edilmelidir. 8. Boncuk İmplantasyonu Istenen test molekülü konsantrasyonunda mikroboncukları veya karşılık gelen araç s inkübeuygun bir hacmi için gerekli bir süre için ların çözüme. Not: Araştırmacı steril Petri 3-6 cm çapında değişen yemekler, veya çözelti içinde mikro-görselleştirme sağlayacak her ikisi de çok-yuvalı plakalar, kullanabilir. Zaman tipi ve ilgili molekülün miktarına bağlı olarak değişebilir ve araştırmacı gibi ışık ve sıcaklık hassasiyeti olarak inkübasyon ve diğer yönleri süresince üretici ya da yayınlanan önerileri başvurmalıdır. Embriyolar istenilen gelişimsel zaman noktasını ulaştığınızda, ince forseps kullanarak chorions embriyolar kaldırın. Çözeltiye bunları alışmaları için 10 dakika boyunca antibiyotik süzüldü Ringer çözeltisi embriyolar inkübe edin. Embriyolar acclimating iken, implantasyon tepsi içinde yer mikroboncuk plaka mikroboncukları transferi ve 10 dakika boyunca Ringer çözeltisi ile durulayın. Not: Bu noktaya ulaştıktan sonra 50 dakika içinde boncuk implante. Bu wHasta bir ilgi, molekülün daha küçük bir konsantrasyon ile bir boncuk implante olasılığını azaltır. Implante edilecek microbead erişilebilir nereye kadar ilgi alanına onları yönlendirmek için özen microbead implantasyon tepsisinin kuyulara embriyolar dizisi. Tungsten iğne kullanılarak embriyo üzerinde küçük bir kesi yapmak. Microcapillary transfer pipet kullanarak embriyo üzerine microbead aktarın: pipet ampul karartıcı, yavaşça kılcal sütuna microbead çekin ve sonra istenen hedefe microbead transfer basıncı boşaltın. Embriyo içinde microbead konumlandırmak için bıyık / kirpik aracını kullanın. Not: iyileşene kadar microbead embriyo ihraç olmayacak şekilde kesi sitesinden uzak dokuya microbead konumlandırmak için emin olun.