عزل الكريات البيض من أنسجة الفئران في واجهة الأم والجنين
Summary
Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.
Abstract
التسامح المناعي في الحمل يتطلب أن النظام المناعي للأم يخضع لتغيرات مميزة من أجل قبول ورعاية الجنين. يبدأ هذا التسامح أثناء الجماع، أنشأ خلال تلقيح والزرع، وحافظت طوال فترة الحمل. يتم إثراء وسطاء الخلوية والجزيئية النشطة التسامح الأم والجنين في موقع التماس بين أنسجة الجنين والأم، والمعروفة باسم واجهة الأم والجنين، والذي يتضمن المشيمة والرحم والأنسجة الساقطية. وتتألف هذه الواجهة من خلايا انسجة والكريات البيض التسلل، ووفرة والمظهرية خصائصها تتغير على مدى فترة الحمل. وتشمل التسلل الكريات البيض في واجهة الأم والجنين العدلات، الضامة، والخلايا الجذعية، الخلايا البدينة، وخلايا T والخلايا B والخلايا القاتلة الطبيعية، والخلايا NKT التي تخلق معا المحلية الصغيرة للبيئة التي تحافظ على الحمل. اختلال التوازن بين هذه الخلايا أو أي inappropيعتبر تغيير riate في الظواهر التي آلية المرض في فترة الحمل. ولذلك، فإن دراسة الكريات البيض التي تتسلل إلى واجهة الأم والجنين أمر ضروري من أجل توضيح الآليات المناعية التي تؤدي إلى مضاعفات متعلقة بالحمل. الموصوفة هنا هو البروتوكول الذي يستخدم مزيجا من التفكك الميكانيكية لطيف تليها تصنيف الأنزيمية قوية مع بروتين وحال للكولاجين كوكتيل الأنزيمية لعزل الكريات البيض التسلل من أنسجة الفئران في واجهة الأم والجنين. هذا البروتوكول يسمح لعزل أعداد كبيرة من الكريات البيض قادرة على البقاء (> 70٪) مع خصائص المستضدات وظيفية الحفظ بما فيه الكفاية. ومن ثم يمكن تحليلها الكريات البيض معزولة من قبل العديد من التقنيات، بما في ذلك المناعي، فرز الخلايا، والتصوير، immunoblotting، مرنا التعبير، زراعة الخلايا، وفحوصات في المختبر وظيفية مثل ردود فعل متباينة الكريات البيض، والانتشار، أو فحوصات السمية الخلوية.
Introduction
التسامح المناعي في الحمل هي فترة عندما تحدث تغيرات مميزة في الجهاز المناعي للأم. هذه التغييرات تسمح الأم لتحمل الجنين، والكسب غير المشروع شبه الصنعية 1. الجنين يعبر عن الأب معقد التوافق النسيجي الرئيسي (MHC) المستضدات 2، وقد تم العثور على خلايا الجنين في الدورة الدموية للأم 3. ومع ذلك، لا يتم رفض الجنين 4،5. ليست مفهومة تماما هذا اللغز.
تنص الفرضية الأخيرة أن التسامح الأم والجنين يتم إنشاؤه أثناء الجماع وتلقيح 6،7 وصيانتها للحفاظ على الحمل فترة ولاية كاملة 10/08. ويعتبر توزيع لهذا التسامح الأم والجنين آلية المرض خلال المراحل المبكرة والمتأخرة من الحمل 10-16. التسامح الأم والجنين ينطوي على مشاركة مختلف المجموعات الفرعية من السكان الكريات البيض، بما في ذلك خلايا T (خلايا T التنظيمي، وخلايا TH1 الخلايا TH2، وخلايا Th17)، لجنة الهدنة العسكريةrophages، العدلات، الخلايا البدينة، الخلايا القاتلة الطبيعية، والخلايا NKT، والخلايا الجذعية، والخلايا B، أن التغير في كثافة وتوطين طوال فترة الحمل 15،17-19. غير المخصب التسامح الأم والجنين على الأم والجنين واجهة 20 – الموقع التشريحي حيث يتفاعل الجهاز المناعي للأم مع الجنين مستضدات 20،21.
يتم إنشاء واجهة الأم والجنين خلال المشيمة عندما خلايا الأرومة الغاذية extravillous الجنين تغزو الغشاء المخاطي في الرحم 22-24. على الجانب الجنين من هذه الواجهة، والأغشية المحيطة بالجنين إنشاء سطح الظهارية المتخصصة في المشيمة، وخلايا الأرومة الغاذية المخلوية السيطرة على صرف المواد الغذائية من خلال الاتصال المباشر مع دم الأم (22). على الجانب الأمهات واجهة، والساقط المجندين تجمع غير متجانس من الكريات البيض التي في الفئران تمثل 30٪ إلى 50٪ من جميع الخلايا الساقطية. بالإضافة إلى مشاركتهم في maternآل التسامح المناعي، وهذه الخلايا هي من أهم المساهمين في عمليات مختلفة خلال فترة الحمل، على سبيل المثال، حماية الجهاز التناسلي من الالتهابات والتلقيح، زرع الجنين 7،25، الأوعية الدموية ساقطي 26، إعادة الأوعية الدموية 24،27، غزو الأرومة الغاذية 28، المشيمة التنمية 24،25، وفي نهاية المطاف والمخاض والولادة 15،17. ولذلك، فإن دراسة الكريات البيض تشارك في التسامح الأم والجنين ضروري لتوضيح التسبب في مضاعفات مرتبطة بالحمل.
في حين أن استخدام المناعية والمناعي ولدت البيانات لرؤية مباشرة وتوطين الرحم، ساقطي، أو الكريات البيض المشيمة 29،30، تحليل التدفق الخلوي وكذلك كشفت مجموعات فرعية محددة من الكريات البيض في كل من هذه الأنسجة 31،32. بالإضافة إلى ذلك، التدفق الخلوي قد استخدمت لتحديد الكثافة ونسبة الأمنال والجنين واجهة الكريات البيض 33 و التعبير مستويات بروتينات الخلية والخلايا 8-10،34. تحليل تدفق cytometric من الكريات البيض في واجهة الأم والجنين يتطلب تعليق وحيد الخلية. من أجل عزل الكريات البيض التسلل من ساقطي، الرحم، والأنسجة المشيمية، وقد استخدمت طريقتين للتفكك النسيج: الميكانيكية والأنزيمية. كلتا الطريقتين تسمح للفصل الكريات البيض تسللوا من المصفوفة خارج الخلية (ECM) من هذه الأنسجة. تفكك النسيج الأنزيمية متفوقة على تفكك النسيج الميكانيكية لأنها تسمح عائدات أعلى من الكريات البيض مع الأضرار المرتبطة القص قوة أقل 35. ونتيجة لذلك، تفارق الأنسجة الميكانيكية يتطلب إلى التجميع الأنسجة 36، والتي قد تزيد من التباين والتغاير من العينات. بعد ذلك، قد يكون التفكك الميكانيكية الخيار عندما يكون المستضد من الفائدة يمكن أن تتغير من التفكك الأنزيمية أو عند وظيفة الخليةأن الحفاظ على الصورة الحاجة الفائدة (على سبيل المثال، السمية الخلوية للخلايا NK) 35.
استخدام التحلل البروتيني مع إنزيمات معينة لتدهور ECM يلغي العائدات المنخفضة لاحظ مع التفكك الميكانيكية. وأفادت العديد من الدراسات أن استخدام التربسين 32، كولاجيناز 37، الدناز 31، dispase 38، والكوكتيلات التجارية من الإنزيمات المختلفة 32،39. ومع ذلك، فإن طبيعة وتركيز الإنزيمات المختلفة ومدة الهضم يجب تحديدها بدقة والتأكد من صلاحيتها لضمان الحفاظ على سلامة الحواتم المستضدية سطح الخلية المطلوبة لالمناعي. الهياكل سطح مختلف عرضة بشكل مختلف لتدمير الإنزيمات المختلفة، مع بعض الإنزيمات، مثل التربسين، كونها سيئة السمعة لتجريد الحواتم سطح الكريات البيض معترف بها من قبل العديد من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة.
قدم هنا هو طريقة استخدام proteolytجيم وكوكتيل الأنزيمية حال للكولاجين، ودعا Accutase. هذا الحل الأنزيمية هو لطيف بما فيه الكفاية في حين لا يزال فعالا في الفصل بين أنسجة الفئران في واجهة الأم والجنين، و لا يتطلب إضافة الكواشف النأي أخرى أو مصل لإنهاء رد فعل التفكك. وعلاوة على ذلك، وانها مستعدة لاستخدام الموردة و، على الرغم من أن الوقت من التفكك يحتاج إلى التحقق، وهو أكثر قوة من الانزيمات المشار إليها أعلاه 40،41.
استخدام مزيج من كلا النوعين من تصنيف الأنسجة يحسن نوعية وكمية من الخلايا التي تم الحصول عليها. وبالتالي، العديد من الدراسات قد نفذت الجمع بين استخدام تفارق الميكانيكية والأنزيمية مع نتائج مرضية 31،32،37. تأسست بروتوكول صفها هنا والتحقق من صحتها في مختبرنا. يستخدم مزيج من التفكك الميكانيكية لطيف تليها تصنيف الأنزيمية القوي. يسمح هذا البروتوكول الدراسة العزلة ومزيد منالكريات البيض التسلل في أنسجة الفئران في واجهة الأم والجنين (الرحم، الساقط، والمشيمة). يحافظ على بروتوكول التالية أيضا على سلامة علامات سطح الخلية وعوائد خلايا قابلة للحياة بما فيه الكفاية لتطبيقات المصب كما يتبين من تحليل تدفق cytometric. أخيرا، ويحافظ على هذا البروتوكول اتساق إعداد الخلايا لتحليل ومقارنة أنسجة الفئران مختلفة تتكون واجهة الأم والجنين.
Protocol
Representative Results
Discussion
جمع البيانات متسقة أن يسجل وفرة والمظهرية خصائص الكريات البيض التسلل في واجهة الأم والجنين ضروري لفهم التسبب في مضاعفات مرتبطة بالحمل. وقد وصفت العديد من التقنيات التي تسهل عزل التسلل الكريات البيض من أنسجة الفئران في واجهة الأم والجنين طوال فترة الحمل 31،38،39،43-46….
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد NGL من قبل مبادرة جامعة واين ستيت في فترة ما حول الولادة صحة الأم وفترة ما حول الولادة وصحة الطفل. نحن نعترف بامتنان مورين McGerty وايمي E. Furcron (جامعة ولاية واين) لقراءة نقدية لها من المخطوطة.
Materials
| Magentic Cell Separation | |||
| MS Columns | |||
| Cell Separator | |||
| 30μm pre separation filters | |||
| Multistand | |||
| 15mL safe lock conical tubes | |||
| MACS Buffer | (0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS) | ||
| Reagents | |||
| Anti-mouse CD16/CD32 | |||
| Anti-mouse extracellular antibodies | (Table 1) | ||
| Sodium azide | |||
| Bovine serum albumin | (BSA) | ||
| LIVE/DEAD viability dye | |||
| Fixation buffer solution | |||
| FACS Buffer | (1% bovine serum albumin, 0.5% sodium azide, and 1X PBS ph 7.2) | ||
| Trypan Blue Solution 0.4% | |||
| Fetal bovine serum | |||
| Additional Instruments | |||
| Incubator with shaker | |||
| Flow cytometer | |||
| Centrifuge | |||
| Vacuum system | |||
| Incubator | |||
| Water bath | |||
| Cell counter | |||
| Microscope |
Referências
- Trowsdale, J., Betz, A. G. Mother’s little helpers: mechanisms of maternal-fetal tolerance. Nat Immunol. 7 (3), 241-246 (2006).
- King, A., et al. Evidence for the expression of HLAA-C class I mRNA and protein by human first trimester trophoblast. J Immunol. 156 (6), 2068-2076 (1996).
- Bonney, E. A., Matzinger, P. The maternal immune system’s interaction with circulating fetal cells. J Immunol. 158 (1), 40-47 (1997).
- Tafuri, A., Alferink, J., Moller, P., Hammerling, G. J., Arnold, B. T cell awareness of paternal alloantigens during pregnancy. Science. 270 (5236), 630-633 (1995).
- Chaouat, G., Petitbarat, M., Dubanchet, S., Rahmati, M., Ledee, N. Tolerance to the foetal allograft. Am J Reprod Immunol. 63 (6), 624-636 (2010).
- Robertson, S. A., et al. Seminal fluid drives expansion of the CD4+CD25+ T regulatory cell pool and induces tolerance to paternal alloantigens in mice. Biol Reprod. 80 (5), 1036-1045 (2009).
- Robertson, S. A., Moldenhauer, L. M. Immunological determinants of implantation success. Int J Dev Biol. 58 (2-4), 205-217 (2014).
- Aluvihare, V. R., Kallikourdis, M., Betz, A. G. Regulatory T cells mediate maternal tolerance to the fetus. Nat Immunol. 5 (3), 266-271 (2004).
- Rowe, J. H., Ertelt, J. M., Xin, L., Way, S. S. Pregnancy imprints regulatory memory that sustains anergy to fetal antigen. Nature. 490 (7418), 102-106 (2012).
- Samstein, R. M., Josefowicz, S. Z., Arvey, A., Treuting, P. M., Rudensky, A. Y. Extrathymic generation of regulatory T cells in placental mammals mitigates maternal-fetal conflict. Cell. 150 (1), 29-38 (2012).
- Saito, S., Sakai, M., Sasaki, Y., Nakashima, A., Shiozaki, A. Inadequate tolerance induction may induce pre-eclampsia. J Reprod Immunol. 76 (1-2), 30-39 (2007).
- Lee, J., et al. A signature of maternal anti-fetal rejection in spontaneous preterm birth: chronic chorioamnionitis, anti-human leukocyte antigen antibodies, and C4d. PLoS One. 6 (2), 0016806 (2011).
- Steinborn, A., et al. Pregnancy-associated diseases are characterized by the composition of the systemic regulatory T cell (Treg) pool with distinct subsets of Tregs. Clin Exp Immunol. 167 (1), 84-98 (2012).
- Gomez-Lopez, N., Laresgoiti-Servitje, E. T regulatory cells: regulating both term and preterm labor. Immunol Cell Biol. 90 (10), 919-920 (2012).
- Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. A., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. Immune cells in term and preterm labor. Cell Mol Immunol. 23 (10), 46 (2014).
- Romero, R., Dey, S. K., Fisher, S. J. Preterm labor: one syndrome, many causes. Science. 345 (6198), 760-765 (2014).
- Gomez-Lopez, N., Guilbert, L. J., Olson, D. M. Invasion of the leukocytes into the fetal-maternal interface during pregnancy. J Leukoc Biol. 88 (4), 625-633 (2010).
- Timmons, B., Akins, M., Mahendroo, M. Cervical remodeling during pregnancy and parturition. Trends Endocrinol Metab. 21 (6), 353-361 (2010).
- Arck, P. C., Hecher, K. Fetomaternal immune cross-talk and its consequences for maternal and offspring’s health. Nat Med. 19 (5), 548-556 (2013).
- Erlebacher, A. Immunology of the maternal-fetal interface. Annu Rev Immunol. 31, 387-411 (2013).
- Wambach, C. M., Patel, S. N., Kahn, D. A. Maternal and fetal factors that contribute to the localization of T regulatory cells during pregnancy. Am J Reprod Immunol. 71 (5), 391-400 (2014).
- Cross, J. C., Werb, Z., Fisher, S. J. Implantation and the placenta: key pieces of the development puzzle. Science. 266 (5190), 1508-1518 (1994).
- Georgiades, P., Ferguson-Smith, A. C., Burton, G. J. Comparative developmental anatomy of the murine and human definitive placentae. Placenta. 23 (1), 3-19 (2002).
- Croy, B. A., et al. Imaging of vascular development in early mouse decidua and its association with leukocytes and trophoblasts. Biol Reprod. 87 (5), (2012).
- Hofmann, A. P., Gerber, S. A., Croy, B. A. Uterine natural killer cells pace early development of mouse decidua basalis. Mol Hum Reprod. 20 (1), 66-76 (2014).
- Lima, P. D., Zhang, J., Dunk, C., Lye, S. J., Anne Croy, B. Leukocyte driven-decidual angiogenesis in early pregnancy. Cell Mol Immunol. , (2014).
- Robson, A., et al. Uterine natural killer cells initiate spiral artery remodeling in human pregnancy. FASEB J. 26 (12), 4876-4885 (2012).
- Lash, G. E., et al. Regulation of extravillous trophoblast invasion by uterine natural killer cells is dependent on gestational age. Hum Reprod. 25 (5), 1137-1145 (2010).
- Kruse, A., Merchant, M. J., Hallmann, R., Butcher, E. C. Evidence of specialized leukocyte-vascular homing interactions at the maternal/fetal interface. Eur J Immunol. 29 (4), 1116-1126 (1999).
- Degaki, K. Y., Chen, Z., Yamada, A. T., Croy, B. A. Delta-like ligand (DLL)1 expression in early mouse decidua and its localization to uterine natural killer cells. PLoS One. 7 (12), 28 (2012).
- Habbeddine, M., Verbeke, P., Karaz, S., Bobe, P., Kanellopoulos-Langevin, C. Leukocyte Population Dynamics and Detection of IL-9 as a Major Cytokine at the Mouse Fetal-Maternal Interface. PLoS One. 9 (9), (2014).
- Blaisdell, A., Erlbacher, E., Yamada, A. T., Croy, B. A., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. Ch. 53. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy. , 619-635 (2014).
- Rinaldi, S. F., Catalano, R. D., Wade, J., Rossi, A. G., Norman, J. E. Decidual neutrophil infiltration is not required for preterm birth in a mouse model of infection-induced preterm labor. J Immunol. 192 (5), 2315-2325 (2014).
- Plaks, V., et al. Uterine DCs are crucial for decidua formation during embryo implantation in mice. J Clin Invest. 118 (12), 3954-3965 (2008).
- Parr, E. L., Szary, A., Parr, M. B. Measurement of natural killer activity and target cell binding by mouse metrial gland cells isolated by enzymic or mechanical methods. J Reprod Fertil. 88 (1), 283-294 (1990).
- Arck, P. C., et al. Murine T cell determination of pregnancy outcome. Cell Immunol. 196 (2), 71-79 (1999).
- Male, V., Gardner, L., Moffett, A. Isolation of cells from the feto-maternal interface. Curr Protoc Immunol. 7 (7), 1-11 (2012).
- Li, L. P., Fang, Y. C., Dong, G. F., Lin, Y., Saito, S. Depletion of invariant NKT cells reduces inflammation-induced preterm delivery in mice. J Immunol. 188 (9), 4681-4689 (2012).
- Collins, M. K., Tay, C. S., Erlebacher, A. Dendritic cell entrapment within the pregnant uterus inhibits immune surveillance of the maternal/fetal interface in mice. J Clin Invest. 119 (7), 2062-2073 (2009).
- Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Mol Reprod Dev. 75 (5), 818-827 (2008).
- Zhang, P., Wu, X., Hu, C., Wang, P., Li, X. Rho kinase inhibitor Y-27632 and Accutase dramatically increase mouse embryonic stem cell derivation. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 48 (1), 30-36 (2012).
- Pang, S. C., Janzen-Pang, J., Tse, Y., Croy, B. A., Yamada, A. T., Croy, B. A., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. Ch. 2. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy. , 21-42 (2014).
- Zenclussen, A. C., et al. Murine abortion is associated with enhanced interleukin-6 levels at the feto-maternal interface. Cytokine. 24 (4), 150-160 (2003).
- Mallidi, T. V., Craig, L. E., Schloemann, S. R., Riley, J. K. Murine endometrial and decidual NK1.1+ natural killer cells display a B220+CD11c+ cell surface phenotype. Biol Reprod. 81 (2), 310-318 (2009).
- Addio, F., et al. The link between the PDL1 costimulatory pathway and Th17 in fetomaternal tolerance. J Immunol. 187 (9), 4530-4541 (2011).
- Shynlova, O., et al. Infiltration of myeloid cells into decidua is a critical early event in the labour cascade and post-partum uterine remodelling. J Cell Mol Med. 17 (2), 311-324 (2013).
- Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
- Gartner, S. The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies. Methods Mol Biol. , 670-672 (2014).
- Quan, Y., et al. Impact of cell dissociation on identification of breast cancer stem cells. Cancer Biomark. 12 (3), 125-133 (2012).
- Gordon, K. M., Duckett, L., Daul, B., Petrie, H. T. A simple method for detecting up to five immunofluorescent parameters together with DNA staining for cell cycle or viability on a benchtop flow cytometer. J Immunol Methods. 275 (1-2), 113-121 (2003).
